Оценка контролируемой активации Т-клеток с помощью фотоактивируемого пептида MHC

Аннотация

Источник: Sanchez, E., et al. пространственный и временной контроль активации Т-клеток с помощью фотоактивируемого агониста. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Это видео демонстрирует метод снижения фотоактивируемого пептид-главного комплекса гистосовместимости с использованием ультрафиолетового излучения. В процессе декажирования обнажается нативная пептидная последовательность, что обеспечивает точную активацию Т-клеток.

Протокол

1. Подготовка стимулирующих стеклянных поверхностей

1. Покрытие восьмилуночного камерного защитного стекла биотинилированным поли-L-лизином (Bio-PLL), разведенным в соотношении 1:500 в дистиллированной, деионизированной воде (ddH₂O). Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре (ОТ).
2. Постирать с помощью H₂O.
3. Сушите в течение 2 часов при RT.
4. Заблокируйте поверхности с покрытием Bio-PLL блокирующим буфером (HEPES-буферизованный физиологический раствор [10 мМ HEPES pH 7,4, 150 мМ NaCl], с 2% BSA) в течение 30 минут в режиме РТ.
   1. Растворите 5 мг поли-L-лизина гидробромида в 1 мл 10 мМ NaPO4, pH 8,5.
   2. Добавьте 125 μмоль (0,55 мг) NHS-биотина (из запаса 100 мг/мл в ДМСО) и проверьте pH реакции. Если pH ниже 8,5, добавьте 2 мкл 4 N NaOH, чтобы поднять его до pH от 8,5 до 9,5.
   3. Вихрь в течение 30 мин.
   4. Погасить реакцию 50 мкл 100 мМ глицина, растворенного в 20 мМ при pH 8,0.
   5. Вращайте на полной мощности в течение 10 минут и переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество Bio-PLL обычно сравнивают с предыдущими препаратами путем нанесения серийных двукратных разведений материала на 96-луночный планшет ИФА и количественного определения содержания биотина после инкубации со стрептавидином, связанным щелочной фосфатазой.
5. Удалите буфер блокировки. Не допускайте пересыхания лунок. Добавьте стрептавидин (100 мкг/мл в блокирующем буфере). Выдерживать в течение 1 ч при температуре 4 °C.
6. Стирать в HBS. Заполните и переверните камерные шиберные колодцы 4 - 5 раз, удаляя из скважин HBS. Не допускайте пересыхания лунок.
7. Добавьте биотинилированные лиганды pMHC и молекулы адгезии на поверхность.
   заметка: MCC и OVA можно фотоклетировать путем добавления защитных групп на основе орто-нитробензила (например, нитрофенилэтила (NPE) или нитровератрилоксикарбонила (NVOC)) к ε-аминогруппе ключевых лизинов (K12 в MCC, K7 в OVA). MCC и OVA в фотоклетке можно получить у коммерческих поставщиков. После воссоздания в водном буфере они сворачиваются в бактериально экспрессируемые I-E^k и H2-K^b с использованием установленных подходов.
8. Валидация фотоактивируемого пептида MCC или OVA
   1. Обезвреживание пептидов, защищенных от НЛОС, путем ультрафиолетового облучения с помощью портативной УФ-лампы (см. Таблицу материалов) в течение 20 минут в режиме РТ.
   2. Импульс 1,0 x 10⁵ АПК с 1 мкМ нестимулирующего пептида (отрицательный контроль, например, Hb), необлученного фотоактивируемого пептида, облученного фотоактивируемого пептида и агонистического пептида (положительный контроль, например, MCC) в течение 1 ч до ночи при 37 °C.
   3. Для стимуляции Т-клеток, экспрессирующих 5С. C7/2B4/И TCR, используйте В-элементы CH12 или CH27. Для стимуляции Т-клеток OT1 используют RMA-s или EL4 клетки тимомы.
   4. Смешайте импульсные АПК с равным количеством Т-клеток в 96-луночных круглых донных планшетах с конечным объемом 200 мкл. Инкубируйте при 37 °C в течение 12 - 24 ч.
   5. Извлекают надосадочную жидкость из каждой лунки и анализируют IL-2 методом иммуноферментного анализа с колориметрическим детектированием стрептавидин-хрен-пероксидазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется подтвердить состояние клеток всех пептидов с помощью масс-спектрометрии с помощью электроспрея перед их возвращением в комплексы MHC.
9. Выполняйте складывание и очистку MHC таким образом, чтобы свести к минимуму воздействие света. Например, завернуть реакции складывания в алюминиевую фольгу и провести гель-фильтрационную хроматографию при выключенной УФ-лампе.
   заметка: Было обнаружено, что фотоактивируемые MCC-I-E^k и OVA-H2-K^b индуцируют УФ-независимую активацию Т-клеток с высокой плотностью, возможно, из-за неполного функционального кейджинга. Следовательно, фотоактивируемый pMHC разбавляют до 10-30-кратного избытка нестимулирующего pMHC (например, I-E^k, содержащего пептид гемоглобина (Hb)) на стадии иммобилизации. Это повышает соотношение сигнал/шум в последующем эксперименте с визуализацией.
10. Для фотоактивации CD4⁺ Т-клеток совместно используют смесь биотинилированного Hb-I-Ek (3 мкг/мл), биотинилированного фотоактивируемого MCC-I-E^k (0,1 мкг/мл) и биотинилированного антитела против H2-K^k класса I (0,5 мкг/мл). Антитела против H2-K^k стимулируют 5C. C7/2B4/И Т-клетки, которые экспрессируют H2-K^k, распространяются по поверхности стекла без активации.
11. Для CD8⁺ Т-клеток используют смесь биотинилированного H2-Db, содержащего пептид KAVYDFATL (1 мкг/мл), биотинилированный фотоактивируемый OVA-H2-Kb (0,1 мкг/мл) и внеклеточный домен молекулы адгезии ICAM-1 (2 мкг/мл, полученный культурой клеток насекомых). ICAM-1 стимулирует образование тесного контакта, задействуя интегрин LFA1 на поверхности Т-клеток.
12. Все белковые смеси вносят в блокирующий буфер с последующей инкубацией в течение 1 ч при RT или не менее 2 ч при 4 °C.
    заметка: Ранее была определена молекулярная плотность на поверхностях такого типа в размере ~8000 на мкм2. Учитывая, что фотоактивируемый pMHC представляет собой ~1/30 биотинилированного белка на поверхности, его плотность составит ~267 молекул на мкм2, прежде чем он начнет уменьшаться.
13. Постирайте, как описано в шаге 1.6, и оставьте в HBS до использования.
14. Добавьте 200 000 CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих соответствующий TCR, в каждую лунку и дайте клеткам прилипнуть при 37 °C в течение 15 минут. После того, как клетки прикрепились к поверхности и распространились по ней, они готовы к фотоактивации и визуализации.
    заметка: Ретровирусная трансдукция эффекторных Т-клеток с помощью флуоресцентных зондов подробно описана в другом месте. Передача сигналов кальция также может быть изучена с использованием нетрансдуцированных Т-клеток, загруженных чувствительным к кальцию красителем Fluo-46. Ратиометрический краситель Fura-2 не рекомендуется, поскольку он требует возбуждения в УФ-диапазоне, что также индуцирует снижение фотоактивируемого pMHC.

2. Получение изображений

1. Для получения изображений используйте инвертированный микроскоп TIRF с совместимым с УФ-излучением объективом 150X. Ультрафиолетовое излучение заданных пользователем областей с помощью цифровой диафрагменной системы, подключенной к ртутной лампе (HBO) мощностью 100 Вт. Направляйте ультрафиолетовый свет от этой лампы на образец с помощью зеркала длиной 400 нм.
2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для локализованной фотоактивации и покадровой съемки. В большинстве экспериментов зонды мониторят как в зеленом, так и в красном каналах с помощью лазеров возбуждения с длиной волны 488 нм и 561 нм соответственно. Лазерный свет направляется на образец с помощью двухполосного дихроичного зеркала, которое также излучает сигнал в ультрафиолетовом диапазоне (для обеспечения снижения частоты). Дополнительную информацию о конфигурации микроскопа см. в таблице материалов и рисунке 1.
3. После установки предметного стекла камеры, содержащей Т-клетки, отрегулируйте настройки для получения TIRF или эпифлуоресцентного освещения, если это необходимо. В режиме реального времени выберите поле клеток, которые экспрессируют интересующий флуоресцентный зонд (зонды). Создание областей микронного масштаба для фотоактивации под отдельными клетками с помощью программного управления.
4. Начните покадровую съемку. Как правило, регистрируется 80 временных точек с интервалом в 5 секунд между каждой временной точкой. Это оставляет более чем достаточно времени для последовательных экспозиций 488 нм и 563 нм, в случае экспериментов с двойным цветом.
5. Через 10 временных точек фотоактивируйте выбранные области, открыв затвор цифровой диафрагмы на 1 - 1,5 с.
6. После завершения таймлапса выберите новое поле ячеек и повторите процесс.

Результаты

Рисунок 1: Конфигурация микроскопа для фотоактивации и визуализации TIRF.

488 нм и 561 нм лазеры используются для TIRF и эпифлуоресцентной визуализации зеленого и красного зондов соответственно. УФ-излучение для фотоактивации берется от ртутной (ртутной) лампы, подключенной к цифровой диафрагменной системе, способной освещать небольшие, определяемые пользователем области. ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Nunc Lab-Tek Камерное защитное стекло	Термофишер Научный	155361
Поли-L-лизина гидробромид	Сигма-Олдрич	П2636	Нужно будет сделать биотинилированный поли-L-лизин
EZ-Link NHS-Биотин	Термофишер Научный	20217	Нужно будет сделать биотинилированный поли-L-лизин
Стрептавидин	Термофишер Научный	434301
BirA-500: Стандартный набор для реакции биотин-беллигазы BirA	алчность	БирА500	Будет использоваться для биотинилирования белков
Биотинилированный Hb I-EK			О сворачивании белка см. ссылку 6. Для биотинилирования используйте набор BirA
Биотинилированный NPE-MCC I-EK	Анаспек		Специальный NPE-MCC (haneradliayl-k(Nvoc)-QATKOH) можно приобрести в Anaspec
Биотинилированное антитело αH2-Kk	BD Biosciences	553591
Биотинилированный NPE-OVA H2-Kb	Анаспек		Пользовательский NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) можно приобрести в Anaspec
Биотинилированный KAVY H2-DB	Анаспек		Пользовательский синтезированный белок (KAVYDFATL) можно приобрести в Anaspec
Биотинилированный ICAM1			Для сворачивания белка см. ссылку в протоколе. Для биотинилирования используйте набор BirA
Ручная УФ-лампа	УВП	УВГЛ-25	Лампу держат < расстоянии 1 см от образца. 30 с света 365 достаточно для обнаруживаемого снижения, 20 мин – для количественного снижения.
Система Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Олимп		Дополнительную информацию о системе визуализации можно найти на рисунке 6
Мозаичная цифровая диафрагма	Андор
Программное обеспечение для слайдбуков	Интеллектуальные инновации в области визуализации