1. Получение CD4+ Th1-эффектора человека/Т-клеток памяти
- Наложите жгут на руку донора, протрите вену спиртом, и введите иглу. Медленно наберите 15 мл крови в вакутайнер, используя ЭДТА в качестве антикоагулянта. Когда кровь будет взята, перед удалением иглы развяжите жгут. Сразу после извлечения иглы надавите на рану стерильной марлей.
- Переложите кровь в пробирку объемом 50 мл. Добавьте RPMI-1640 при RT в соотношении 1:1 (конечный объем 30 мл). Осторожно наложите разбавленную кровь на две пробирки по 50 мл, содержащие 15 мл предварительно отфильтрованной среды для выделения лимфоцитов, такой как Ficoll-Paque в ЛТ.
- Центрифугируйте градиент при RT в течение 30 мин при давлении 1 200 x g в качающемся роторе ведра. Во время центрифугирования готовят Т-клеточную среду (500 мл RPMI-1640, 50 мл FCS, 5 мл пенициллина/стрептомицина).
- После извлечения пробирки объемом 50 мл из центрифуги обратите внимание на четыре слоя: гранулу эритроцитов на дне, пакетку, слой клеток, содержащий лейкоциты (включая лимфоциты) и плазму. Осторожно удалите слой лейкоцитов с помощью пипетки Пастера и перенесите его в пробирку Falcon объемом 50 мл.
- Промойте слой лейкоцитов, добавив RT RPMI-1460 (до 20 мл) и центрифугируя в RT в течение 5 мин при 1200 x g. Ресуспендируйте лейкоциты в 1 мл Т-клеточной среды. Добавьте 5 мкл клеточной суспензии объемом 1 мл в среду Т-клеток объемом 250 мкл в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и осторожно перемешайте вверх и вниз с помощью пипетки.
- Добавьте 25 мкл разбавленной клеточной суспензии до 25 мкл 0,4% трипанового синего. Добавьте по 10 мкл смеси с каждой стороны стандартного гемоцитометра.
- Поместите гемоцитометр на маломощный световой микроскоп. С помощью объектива 10X подсчитывают количество живых клеток, которые исключили трипановый синий краситель и присутствуют в среднем квадрате с обеих сторон гемоцитометра.
- Чтобы рассчитать концентрацию клеток, умножьте среднее значение 2 квадратов на 100 (коэффициент разведения), а затем умножьте на 104, чтобы получить количество клеток/мл.
- Отрегулируйте конечную концентрацию до 0,5 x 106 клеток/мл в Т-клеточной среде. Добавьте в клетки концентрацию 1 мкг/мл бактериального суперантигена: стафилококкового энтеротоксина В (SEB) и токсикоза 1 (TSST) синдрома токсического шока 1 (TSST). Культивирование в течение 72 ч (37 °C и 5%CO2) для увеличения популяции CD4+ Т-клеток.
- Пеллеты Т-клеток (1,200 х г, 5 мин) и ресуспендируют в концентрации 0,5 х 106 клеток/мл в Т-клеточной среде с добавлением человеческого ИЛ-15 (20 нг/мл). Перенесите лимфоциты в колбу Т150. Продолжайте расширять/разделять клетки в полной среде - IL-15 каждые 24-48 часов по мере необходимости (в зависимости от цвета среды; т.е. всякий раз, когда среда меняет цвет с розового на слегка желтый) впоследствии. Поддерживайте полученную популяцию лимфоцитов до 15 дней.
заметка: По замыслу, этот протокол будет активировать и расширять подмножество CD4+ Т-клеток, которые реактивны к SEB и TSST, а затем направлять их к Th1-подобному эффектору/фенотипу памяти. Другие белые кровяные тельца не могут выжить и расти в этих условиях, так что к шагу 1.10 клетки будут состоять по меньшей мере на 95% из CD4+, CD45RO+ Т-клеток, что можно легко оценить с помощью проточной цитометрии. При желании, дальнейшая очистка может быть легко достигнута с помощью коммерчески доступных наборов для положительной или отрицательной селекции на основе антител/магнитных шариков.
2. Начало первичной культуры эндотелиальных клеток человека
- Покройте колбу Т25 фибронектином (FN) 20 мкг/мл в PBS в стерильных условиях. Оставьте на RT на 30-60 минут. Удалите FN и добавьте 5 мл полной среды (среда Endothelial Basal Medium (EBM-2) с добавлением синглквот Endothelial Growth Medium (EGM-2)). Перед инкубацией в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C не менее 30 минут.
- Разморозьте флакон с замороженными микрососудистыми эндотелиальными клетками легких человека человека или кожными микрососудистыми эндотелиальными клетками (HLMVEC или HDMVECs) на водяной бане при температуре 37 °C с периодическим легким перемешиванием в течение ~2-3 мин. Немедленно перенесите клетки в колбу T25, содержащую предварительно подогретую среду. Аккуратно взболтайте и поместите в инкубатор при температуре 37 °C.
- Меняйте среду через ~4-6 часов. Продолжайте менять среду примерно каждые 48 часов (или когда среда станет слегка желтой) до тех пор, пока пластина не достигнет ~90-95% плавности.
3. Общее расщепление и экспансия эндотелиальных клеток
- Выращивайте клетки до ~90-95 конфлюенции. На это может уйти 2-5 дней. Для расщепления удалите носитель и промойте PBS. Удалите PBS и замените его минимальным объемом свежего 1x трипсина (0,5 мл для Т25 или 1,5 мл для Т75). Аккуратно взболтайте, чтобы покрыть все поверхности трипсином. Инкубировать при 37 °C в течение ~5 минут. Следите за отделением клеток от пластины с помощью маломощного светового микроскопа.
- Когда большинство клеток окажутся округлыми или отделившимися, добавьте 5 объемов (т.е. по сравнению с добавленным объемом трипсина) предварительно нагретой полной среды EGM-2 и аккуратно проведите пипеткой по поверхности колбы, чтобы отделить все клетки.
- Подсчитайте эндотелиальные клетки с помощью гемоцитометра, как описано в 1.6-1.7. Гранулируйте клетки центрифугированием (5 мин, 1 200 x г). Удалите надосадочную жидкость. Отрегулируйте концентрацию до 0,5 млн клеток на мл путем добавления предварительно нагретой полной среды EGM-2 MV.
- Переложите аликвоты клеток в соответствующие посуды или колбы с покрытием FN для обслуживания. Аккуратно взболтайте и поместите в инкубатор. Замените носитель в течение 6-12 часов после нанесения покрытия. После этого носители следует менять примерно каждые 48 часов.
4. Трансфекция эндотелиальных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные эндотелиальные клетки рефрактерны к трансфекции наиболее распространенными химическими методами и методами электропорации. Описанный ниже метод на основе ядерной трансфекции позволяет обеспечить относительно высокую эффективность трансфекции (~50-70%). Эффективным альтернативным методом является использование инфекции соответствующими вирусными векторами (см. комментарии в таблице материалов).
- Подготовьте колбы T25 или T75 (по мере необходимости) HLMVEC или HDMVEC до конечной плотности 90-95% конфлюенции. Покрытие фибронектином (FN) 20 мкг/мл в PBS в стерильных условиях либо микроскопические планшеты, такие как планшеты Delta-T (для стадии 5), либо круглые стеклянные покровные стекла 12 мм, помещенные в лунку 24-луночного планшета для культивирования клеток (для стадии 6) с помощью описанного выше (2.1).
- Добавьте 1 мл полной питательной среды EGM-2 в культуральные планшеты микроскопа или по 0,5 мл в каждые 24 лунки и уравновесьте планшеты в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C/5% CO2.
- Соберите и подсчитайте эндотелиальные клетки, как показано на шагах 3.1-3.3. Центрифугируйте необходимый объем клеток (0,5 млн клеток на образец) при концентрации 1200 x g в течение 5 мин в режиме RT. Тщательно ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл раствора для ядерной трансфекции RT на образец.
- Соедините 100 мкл клеточной суспензии с 1-5 мкг ДНК. Перенос суспензии клеток/ДНК в сертифицированную кювету; Образец должен покрывать дно кюветы без пузырьков воздуха.
Конструкты, нацеленные на YFP или DsRed к клеточной мембране (через N-концевые 20 аминокислот нейромодулина, которые содержат сигнал для посттрансляционного пальмитоилирования), использовали отдельно (мембрана-только YFP или только мембрана-DsRed) или совместно трансфицировали цитоплазматический объемный маркер (например, мембрану-YFP и растворимый DsRed). Можно использовать множество перестановок флуоресцентных белковых маркеров.
- Закройте кювету колпачком. Вставьте кювету с клеточной/ДНК-суспензией в держатель кюветы электропоратора и примените программу электропорации S-005. Выньте кювету из держателя после завершения программы.
- Добавьте ~500 мкл предварительно уравновешенной питательной среды в кювету и аккуратно удалите клеточную суспензию из кюветы с помощью пластиковых пипеток для переноса, входящих в комплект для ядерной трансфекции.
- Для экспериментов с использованием микроскопа культивальные планшеты разделяют клеточную суспензию из одной реакции поровну между двумя чашками, содержащими предварительно подогретые среды (шаги 4.2-4.3). Для экспериментов с использованием 24 лунок/планшетов разделите одну реакцию поровну между 3 лунками.
- Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2 и меняйте среду через 4-6 часов, а затем через 12-16 часов после трансфекции.
5. Визуализация и анализ живых клеток
- Подготовка эндотелия
- День 0: Котрансфектируйте первичные HLMVEC мембраной-YFP и растворимым DsRed с помощью технологии нуклеофекции, как описано на шаге 4, и нанесите на планшеты для визуализации живых клеток.
- День 1: Замените среду свежей средой, содержащей ИФН-γ (100 нг/мл) для стимуляции экспрессии MHC-II. В день 2. Стимулируйте трансфицированные клетки путем добавления 20 нг/мл TNF-α к существующим средам.
- На 3-е сутки инкубируют эндотелий с 1 мкг/мл бактериальных суперантигенов стафилококкового энтеротоксина В (SEB) и токсико-шокового токсина 1 (TSST) при 37 °C в течение 30-60 мин непосредственно перед экспериментами. Пропустите этот шаг для условий контроля '-Ag'.
- Подготовка лимфоцитов
- Параллельно с шагом 5.1.3 готовят буфер А (фенол без красных HBSS) с добавлением 20 мМ HEPES, pH 7,4 и 0,5% v/v сывороточного альбумина человека, предварительно подогретого до 37 °C. Возьмите образец культивируемых лимфоцитов и определите плотность путем подсчета с помощью гемоцитометра (Шаг 1.12-1.17).
- Центрифугируйте 2 миллиона клеток на образец при давлении 1200 x g в течение 5 минут при RT в конической пробирке объемом 15 мл. Аспирируйте среду и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл буфера А таким образом, чтобы не осталось клеточных кластеров.
- Удалите свежую аликвоту кальциевого красителя Fura-2 и повторно суспендируйте в ДМСО до получения исходной концентрации 1 мМ.
- Добавьте 2 μл стокового раствора Fura-2 в суспензию Т-клеток (конечная концентрация 2 μM), закройте пробирку крышкой и немедленно перемешайте, перевернув пробирку, чтобы обеспечить равномерное диспергирование красителя. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут.
- Центрифугу, как на шаге 5.2.2. Аспират Буфер-А и мягко, но тщательно ресуспендирует лимфоциты в 20-40 мкл свежего Буфера-А.
- Настройка и сбор изображений живых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуоресцентной визуализации живых клеток на вертикальных и инвертированных световых микроскопах можно использовать широкий спектр систем. Основные требования включают в себя источник флуоресцентного света и фильтры, ПЗС-камеру, моторизованное переключение фильтров и затворы, столик с подогревом (или камеру с подогревом, устанавливаемую под микроскоп) и программное обеспечение для автоматического получения изображений. Для этого протокола требуется высокая числовая апертура и большое увеличение (т.е. 40X, 63X) масляные иммерсионные линзы для достижения необходимого пространственного разрешения. Особое внимание следует уделять выбору подходящего источника флуоресценции и линз для визуализации кальция на основе Fura-2, поскольку не все из них совместимы с требуемыми длинами волн возбуждения 340/380 нм. Альтернативный подход (совместимый со стандартными наборами зеленых и красных флуоресцентных фильтров) может быть использован с нератиометрическими кальциевыми чувствительными красителями (например, Fluo-4, Rhod-3), хотя они не могут точно количественно оценить кальциевый поток и обеспечивают только относительное/количественное считывание.
- Включите систему микроскопа (ПК для работы, микроскоп, ПЗС-камеру, колесо фильтров и ксеноновую лампу).
- Откройте соответствующее программное обеспечение.
- Настройка микроскопа/программного обеспечения для автоматизированной многоканальной цейтраферной визуализации. Включает последовательный сбор дифференциального интерференционного контраста (DIC), стандартной зеленой флуоресценции, стандартной красной флуоресценции и стандартных изображений Fura-2 с возбуждением 340 и 380 нм. Установите интервал для сбора данных в 10-30 секунд и общую продолжительность ~20-60 минут.
- Установите время экспозиции для визуализации Fura-2.
- Добавьте свежее объективное масло и установите чашку для микроскопа, содержащую всего 0,5 мл Buffer-A, на адаптер нагревательного столика и немедленно включите для балансировки до 37 °C (займет ~2-3 минуты).
- Добавьте находящиеся в состоянии покоя лимфоциты, загруженные Fura2, в установленную камеру для микроскопа с помощью пипетки объемом 20 мкл.
- Включите визуализацию яркого поля. Выберите путь света к окулярам. С помощью ручки грубой фокусировки соприкоснитесь объективом с дном чашки микроскопа. Используйте окуляр и ручку тонкой фокусировки, чтобы сфокусироваться на Т-клетках, расположенных на дне чашки.
- Используйте элементы управления x-y для выбора поля, содержащего не менее 10 ячеек. Избегайте переполненных полей и скоплений клеток, так как они приведут к появлению артефактов визуализации.
- Переключитесь с яркого поля на флуоресцентный источник света. Переключение с окулярного изображения на ПЗС-камеру. Задайте параметры сбора данных (например, время экспозиции, усиление детектора и группирование). С помощью программного обеспечения можно получить снимки покоя Fura2-340 и Fura2-380 (начиная с одинакового времени экспозиции для каждого, обычно в диапазоне ~200-1000 мс).
- Используйте методы, описанные в шаге 5.4.1, для расчета Fura2-340/Fura2-380 для каждого лимфоцита. Выполняйте повторные итерации настройки времени экспозиции Fura2-340 и Fura2-380, получения изображений и вычисления соотношений до тех пор, пока средние значения не приблизятся к 1.
- Установите время экспозиции для mem-YFP и DsRed.
- Замените чашку для микроскопа, используемую на шаге 5.3.3.1, на чашку для микроскопа, содержащую трансфицированные, активированные и обработанные SAg (или необработанные; контрольные) HLMVEC или HDMVEC из инкубатора для клеточных культур (шаги 4.5.1). Используйте одноразовую переводную пипетку для быстрого удаления среды, промойте один раз добавлением ~1 мл предварительно подогретого Buffer-A. Аспират, а затем добавить 0,5 мл Buffer-A.
- Определите поля, в которых присутствуют ярко флуоресцентные положительные трансфектантные эндотелиальные клетки, которые выглядят здоровыми с хорошо сформированными межклеточными соединениями.
- Настройте параметры сбора данных (например, время экспозиции, усиление детектора и биннинг) для mem-YFP и DsRed. Убедитесь, что средняя интенсивность сигнала флуоресценции в каждом канале находится в диапазоне от 25% до 75% от динамического диапазона детектора.
- Проведение экспериментов по визуализации живых клеток.
- Используйте автоматизированное программное обеспечение, чтобы начать получение изображений и захватить несколько интервалов изображений, чтобы установить базовый уровень.
- Во время регистрации нанесите ~5 мкл концентрированных лимфоцитов, загруженных Fura-2 (из шага 5.2), в центр поля визуализации микроскопа, вставив кончик пипетки небольшого объема (P-5 или P-20) в среду, расположенную близко к центру объектива, и медленно выбрасывая.
- По мере того, как лимфоциты оседают в поле визуализации, вносите тонкие корректировки в фокус, чтобы гарантировать, что интерфейс Т-клеток-эндотелиальных клеток (иммунологические синапсы) сохраняется в фокальной плоскости. При объективах 40 и 63X оптимальным является ~10-20 ячеек на поле. Если в поле визуализации наблюдается меньшее количество клеток, повторите шаг 5.3.4.2.
- После того, как желаемый интервал наблюдения в эксперименте завершен, продолжайте визуализацию и немедленно пипетируйте иономицин непосредственно в чашку микроскопа (используя метод, описанный в пункте 5.3.4.2) до конечной концентрации 2 мкМ, чтобы индуцировать максимальный поток кальция/сигнальный сигнал Fura-2 (т.е. средство калибровки, см. анализ 5.4.).
