$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Трансгенная мышиная модель развития рака молочной железы
- Наблюдайте за мышами с желаемой моделью рака на предмет соответствующего роста опухоли с помощью пальпации или измерения штангенциркуля, прежде чем продолжить.
заметка: Здесь была использована трансгенная мышиная модель развития рака молочной железы (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). У этих животных спонтанно развиваются инвазивные карциномы молочной железы в возрасте от 6 до 12 недель в каждой молочной железе. Нормальные молочные железы были использованы в качестве контрольной группы из трансген-отрицательных, сопоставимых по возрасту однопометников.
2. Внутривенное введение специфических и неспецифических антител
- Очистите антитела против мышей B7-H3 и антимышиного иммуноглобулина G (IgG) на обессоливающей колонне (например, PD-10) для удаления консервантов и буферов для хранения, следуя инструкциям производителя.
заметка: Некоторые антитела могут нуждаться в дальнейшей очистке с помощью протокола на основе агарозных гранул Protein-A.
- Аликвотные дозы 33 мкг конъюгата каждого антитела в отдельных микроцентрифужных пробирках.
заметка: Дозировка вводимого агента может варьироваться в зависимости от области применения и соответствовать дозировкам, при которых обычно используется конъюгат антител. Концентрация растворов антител требуется, если объем превышает 100 мкл для безопасности животных.
- В желаемый момент времени перед забором ткани, в течение 96 ч, обезболите животное-носитель опухоли 2% изофлураном, протекающим в кислороде со скоростью 2 л/мин, и поместите в нагреваемую при температуре 37 °С. Ущипните палец ноги, чтобы убедиться, что до процедуры был достигнут надлежащий уровень анестезии.
- Чтобы подготовиться к посеву в хвостовую вену растворами антител, продезинфицируйте хвост животного, трижды протерев его спиртовой салфеткой. Расширьте хвостовые вены, согрев их грелкой в течение примерно 30 секунд. Избегайте нагрева всего животного. Протрите хвост еще раз спиртовой салфеткой после снятия грелки.
- С помощью катетера для лечения хвостовой вены 27G введите иглу-бабочку в одну из двух боковых хвостовых вен и аккуратно зафиксируйте хвост с введенной иглой к сцене с помощью кусочка хирургической ленты.
заметка: Видимый обратный приток крови в катетер указывает на правильное расположение иглы в хвостовой вене .
- Промойте катетер 25 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), затем введите раствор антитела в катетер с помощью инсулиновых шприцев. Промойте катетер еще раз 25 мкл стерильного PBS.
- Извлеките иглу из хвоста и надавите, чтобы остановить кровотечение.
- Выключите анестезию и наблюдайте за животным до полного пробуждения на предмет любых признаков дистресса.
3. Сбор и подготовка тканей-мишеней опухоли
- В желаемый момент времени гуманно усыпить животное в соответствии с приемлемой институциональной процедурой, здесь путем постепенного вдыхания 100% CO2 из баллона со сжатым газом с расходом в камере 10-30% объема/мин.<бр/>
заметка: Некоторые применения метода IVIL требуют эвтаназии путем перфузии сердца с PBS для удаления свободно циркулирующих антител.
- После подтверждения гуманной эвтаназии путем прекращения дыхательной и сердечной деятельности, отсутствия реакции на защемление пальца ноги и посерения слизистых оболочек опухолевые ткани с помощью хирургических ножниц и щипцов иссекают опухолевые ткани следующим образом:
- Уложите мышь в положение лежа на спине и, захватив щипцами только внешний слой кожи между набором молочных желез, ближайших к хвосту (5-м), сделайте небольшой надрез парой хирургических ножниц.
- Введите закрытые ножницы в разрез и медленно откройте кончик, чтобы осторожно отделить кожу от подлежащей мембраны брюшной стенки, сохранив ее неповрежденной.
- Сделайте вертикальный разрез вверх по животу, продолжая отделять кожу от внутренней оболочки. Между 3-й и 4-й молочными железами сделайте горизонтальный разрез поперек живота, чтобы обеспечить втягивание кожи и визуализацию молочных желез><.
заметка: Опухоли и железы молочных желез располагаются поверхностно под кожей.
- Захватывая каждую опухоль или нормальную железу щипцами, аккуратно срезайте прикрепленную кожу с помощью хирургических ножниц.
- Поместите вырезанные ткани в формы для одноразовой основы для тканей, предварительно маркированные и заполненные средой для встраивания с оптимальной температурой резки (OCT), и быстро заморозьте формы, поместив их на сухой лед. Чтобы изучить нецелевую доставку, иссекайте другие ткани или органы, представляющие интерес (например, печень или легкие).
заметка: Чтобы приостановить протокол на этом этапе, храните замороженные блоки тканей при температуре -80 °C до тех пор, пока не будете готовы к продолжению.
- С помощью криостата разрезать замороженные тканевые блоки толщиной 10 мкм и поместить соседние срезы на предварительно маркированные адгезионные стеклянные стекла><.
заметка: Чтобы приостановить протокол на этом этапе, храните предметные стекла при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к продолжению.
4. Протокол окрашивания ex vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного сравнения изображений флуоресцентной микроскопии, все стекла окрашиваются одновременно одними и теми же приготовленными растворами.
- Промойте замороженные предметные стекла комнатной температуры PBS в течение 5 минут для удаления ОКТ.
- Разграничьте срезы тканей с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы уменьшить объем растворов, необходимых во время окрашивания.
заметка: Будьте осторожны, не позволяйте ручке скользить по образцам ткани, так как это может либо удалить ткань со предметного стекла, либо помешать правильному окрашиванию пораженной части ткани. Ни в коем случае не допускайте обезвоживания участков тканей.
- Зафиксируйте срезы тканей 4% раствором параформальдегида на 5 минут.
- Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут.
- Пермеабилизируйте срезы тканей 0,5% Тритоном-Х 100 в PBS в течение 15 мин.
- Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут.
- Блокируйте ткани 3% б/в бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 5% v/v козьей сыворотки, оба в PBS (блокирующем растворе) в течение 1 ч при комнатной температуре><.
заметка: Сопоставьте сыворотку блокирующего раствора с вторичным антителом животного-хозяина.
- Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут.
- По желанию инкубируйте срезы с первичными антителами, ведущими учет, возможно, с общим ядерным (например, DAPI), сосудистым (например, CD31) или цитоплазматическим маркером (например, актином). Здесь крысиный антимышиный CD31 (сосудистый маркер) в разведении 1:100 использовали в соответствии с инструкциями производителя в блокирующем растворе в течение ночи при 4 °С, защищенном от обезвоживания, на лотке для слайдов.
заметка: Не добавляйте дополнительные первичные антитела или конъюгат антител. Конъюгат, который был введен и которому позволили накопиться в тканях in vivo, выступает в качестве первичного антитела.
- Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут три раза, каждый раз меняя PBS.
- Инкубируйте предметные стекла со вторичными антителами, чтобы пометить первичные антитела. Для этого применения визуализируйте антитела против B7-H3 с использованием конъюгированного козьего антитела против кролика AlexaFluor-546 (разведение 1:200, оптимизированное в соответствии с инструкциями производителя) и CD31 с вторичным антителом против козы AlexaFluor-488 против крысы (разведение 1:200, оптимизированное в соответствии с инструкциями производителя) в блокирующем растворе, защищенном от света и обезвоживания на лотке для слайдов, в течение 1 часа при комнатной температуре.
заметка: Вторичные антитела принадлежат одному и тому же животному-хозяину, но соответствуют аффинности вторичных антител к виду хозяина соответствующего первичного антитела. С этого момента горки защищены от света.
- Промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут три раза, каждый раз меняя PBS.
- Нанесите одну каплю монтажного средства в центр среза ткани и осторожно установите покровный лист, избегая попадания пузырьков воздуха.
- Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть.
заметка: Чтобы приостановить протокол на срок до недели на этом этапе, храните предметные стекла при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут готовы к продолжению.
5. Конфокальная микроскопия и количественный анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка конфокального микроскопа и параметры визуализации будут зависеть от используемой конфокальной системы. Используемый здесь микроскоп был приобретен на коммерческой основе (например, система Zeiss LSM 510 Meta) и использовалось соответствующее программное обеспечение для сбора данных (например, Zen 2009). Тем не менее, многие из этих шагов применимы к любому конфокальному микроскопу и предполагают базовые знания конфокальной микроскопии.
- После того как система была включена и прогрета, выберите нужный объектив, в данном случае использовался объектив 20x (числовая апертура = 0,8).
- Загрузите заслонку с положительным управлением, опустите крышку, чтобы можно было настроить оптимизацию для самого яркого сигнала. Визуализируя изображение в красном канале, фокусируйте систему на образце в режиме Live imaging mode.
- Для каждого используемого лазерного канала оптимизируйте интенсивность лазера, коэффициент усиления и размер точечного отверстия следующим образом:
- Переключитесь в непрерывный режим для визуализации.
- Оптимизируйте ползунки Laser Intensity (которая контролирует мощность лазера) и Gain (Master) (которая контролирует напряжение для фотоумножителя) при мониторинге гистограммы Look Up Table (LUT). Регулируйте эти два параметра до тех пор, пока динамический диапазон гистограммы не заполнится без насыщения пикселей.
заметка: Если интенсивность лазера слишком высока, произойдет фотообесцвечивание. Если Gain (Master) будет слишком высоким, изображение станет зашумленным. В идеале Gain (Master) должен находиться в середине своего диапазона.
- Установите отверстие на 1 воздушную единицу (AU), что дает самое высокое разрешение и самый тонкий z-срез.
- Сдвиньте полосу цифрового смещения, чтобы свести к минимуму минимальный уровень шума на гистограмме таблицы LUT и получить настоящий черный фон.
заметка: После того как настройки микроскопии оптимизированы для каждого лазерного канала и объектива, поддерживайте их постоянными на протяжении всего сеанса визуализации и для визуализации всех предметных стекол, чтобы обеспечить количественное сравнение между предметными стеклами.
- На вкладке Режим сбора данных в разделе Усреднение выберите нужное число и битовую глубину. Нажмите кнопку Оптимальный, чтобы установить оптимальный размер пикселя.
- Используйте кнопку захвата Snap для получения высококачественного изображения. Здесь были выбраны случайные поля зрения изнутри опухоли, но для других применений могут применяться и другие области интереса (сосуды, края опухоли, глубина проникновения и т. д.).
- Сохраняйте файлы изображений в формате, используемом конфокальным программным обеспечением (в данном случае ".lsm") для обработки и количественной оценки в автономном режиме.
заметка: Если не все слайды были изображены во время одного сеанса, сохраните настройки и перезагрузите их при последующих посещениях, хотя повторное изображение одного и того же слайда не рекомендуется из-за фотообесцвечивания.
- Выполните количественные измерения интенсивности флуоресценции. Откройте Fiji (программное обеспечение Fiji Is Just ImageJ) и загрузите файл изображения .lsm, перетащив его в строку состояния.
- Разделите данные цветового канала. Перейдите в раздел Изображения > Стеки > Разделенные каналы.
- При необходимости выполните предварительную обработку флуоресцентных изображений, т. е. вычтите фоновый сигнал (Process > Subtract Background) или уменьшите шум с помощью метода фильтрации.
- Сегментируйте цветовой канал, соответствующий эталонному белку (сосудистому, ядерному, клеточному окрашиванию), установив порог интенсивности сигнала (Изображение > Настройка > порога).
заметка: Ручное установление пороговых значений вносит субъективность в анализ изображений, поэтому использование автоматизированного алгоритма порогового значения или обращение к гистограммам изображений делает результаты анализа изображений менее предвзятыми.
- Используйте этот порог для создания двоичной маски (Process > Binary > Convert to Mask).
- Измеряйте и помечайте ROI в маске (Анализ > Анализ частиц > Отметьте Добавить в Менеджер > OK).
- Примените ROI к цветовому каналу, соответствующему интересующему антителу (Щелкните изображение канала, Анализ > Инструменты > Менеджер ROI > Измерить). Это приведет к применению ROI маски к изображению антитела и обеспечит измерения изображения для разделов этикетки в окне «Результаты». Окно сохранения результатов (Файл > Сохранить).
- Рассчитайте желаемую интересующую вас статистику, такую как средняя интенсивность флуоресценции, как описано здесь.
- Выполняйте все этапы обработки идентично каждому изображению в наборе слайдов. Создайте макрос, чтобы автоматически делать это для больших пакетов изображений.
- Для отображения изображения только после количественных измерений примените качественную корректировку изображения, чтобы оптимизировать визуализацию закономерностей биораспределения, настроив минимум, максимум, яркость и контрастность до одинаковых уровней на всех слайдах (Изображение > Настройка > Яркость/Контрастность).
- Преобразуйте тип изображения (Image > Type > RGB Color) и сохраните файлы в формате изображения без потерь, например .tiff (File > Save As > Tiff...) для использования в презентациях и публикациях.