Мультиплексный иммуноферментный анализ на основе гранул для выявления патоген-специфических антител в слюне

Abstract

Источник: Augustine, S. A. J., et al. Разработка мультиплексного иммуноферментного анализа на антитела к слюне для измерения воздействия на человека патогенов окружающей среды. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется метод мультиплексного иммуноферментного анализа на основе гранул для одновременного обнаружения антител к нескольким патогенам окружающей среды в слюне человека. Флуоресцентные шарики были связаны с антигенами различных патогенов, которые были захвачены с помощью антител в образце человеческой слюны. После мечения антител с помощью флуоресцентного репортера гранулы анализировали с помощью проточной цитометрии для оценки наличия различных патоген-специфических антител в слюне.

Protocol

1. Бортовая муфта

1. Соедините антигены с наборами шариков, используя концентрации, указанные в таблице Таблица 1.
2. Добавьте каждый антиген к активированным гранулам и доведите общий объем до 500 мкл в 50 мМ MES, pH 5,0. Смешайте антигены и бусины по вихрю.
3. Инкубировать антигены и шарики в течение 2 ч с перемешиванием вращением (~15 об/мин) при комнатной температуре в темноте. Гранулировать связанные шарики микроцентрифугированием при 10 000 x g в течение 2 мин.
4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS)-бычьего сывороточного альбумина (BSA)-полиоксиэтиленсорбитана монолаурата (Tween-20)-азида натрия (PBS-TBN) pH 7,4 с помощью вихревой и ультразвуковой обработки. Гранулируйте гранулы методом микроцентрифугирования при температуре 10 000 x g в течение 2 минут и удалите надосадочную жидкость.
   Внимание: Азид натрия является остротоксичным химическим веществом. Он приводит к летальному исходу при проглатывании или попадании на кожу. Не дышите пылью/парами/газами/туманом/парами и не распыляйте их. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при обращении с ним и его утилизации в соответствии с соответствующими законами.
5. Ресуспендируйте шарики в 1 мл PBS-TBN с помощью вихря и ультразвука на 20 сек.
6. Гранулировать шарики методом микроцентрифугирования при 10 000 x g в течение 2 мин.
7. Повторите шаги 1.5 и 1.6.
   Примечание: Это обеспечивает всего две промывки с PBS-TBN.
8. Ресуспендируйте соединенные и промытые шарики в 1 мл PBS, 1% BSA, 0,05% Azide, pH 7,4. Храните спаренные бусины в холодильнике при температуре 2-8 °C в темноте.

2. Мультиплексный иммуноферментный анализ слюны

1. Достаньте слюну из морозильной камеры при температуре -80 °C и дайте ей оттаять при комнатной температуре.
2. Ресуспендирование антиген-сопряженных прикладов с помощью вихря и ультразвука в течение 20 сек.
3. Приготовьте рабочую смесь шариков, разбавив связанные шарики до конечной концентрации 100 бусин/мкл каждого уникального набора шариков в буфере PBS-1% BSA.
4. Приготовьте разведение слюны в соотношении 1:4 с буфером PBS-1% BSA в 96-луночном глубоколуночном планшете.
5. Предварительно смочите фильтрующую пластину 100 мкл промывочного буфера и удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума.
6. Добавьте 50 μл рабочей смеси шариков и равный объем разбавленной слюны в 95 лунок 96-луночных фильтровальных пластин для окончательного разбавления 1:8. Перемешивайте реакции с помощью многоканального пипеттора. В одну контрольную лунку добавьте 50 мкл антиген-сопряженных шариков плюс 50 мкл буфера PBS-1% BSA (в качестве замены слюны).
7. Накройте крышкой и дайте поинкубироваться в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа на микропланшетном шейкере при 500 оборотах в минуту. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Промойте лунки 100 мкл промывочного буфера и удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Повторите стирку 1 раз.
8. Ресуспендируйте гранулы в 50 мкл PBS-1% BSA с помощью многоканального дозатора.
9. Разбавьте биотинилированное антитело IgG к человеку до 16 мкг/мл в PBS-1% BSA.
10. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл разведенного вторичного антитела и перемешайте содержимое многоканальным пипеттором.
11. Накройте фильтрующую пластину крышкой и дайте ей инкубироваться в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут на вибростенде. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Промойте лунки 100 мкл промывочного буфера и удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Повторите стирку 1 раз.
12. Ресуспендируйте гранулы в 50 мкл PBS-1% BSA с помощью многоканального дозатора.
13. Разбавьте стрептавидин-R-фикоэритрин репортер (SAPE) до 24 мкг/мл в PBS-1% BSA.
14. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл репортера и перемешайте многоканальным пипеттором.
15. Накройте фильтрующую пластину крышкой и дайте ей инкубироваться в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут на вибростенде. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Промойте лунки 100 мкл промывочного буфера и удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума. Повторите стирку 1 раз.
16. Ресуспендируйте гранулы в 100 мкл PBS-1% БСА и проанализируйте 50 мкл с помощью анализатора.
    Примечание: Результаты мультиплексного иммуноанализа измеряются в средних единицах интенсивности флуоресценции (MFI). Во избежание ошибок всегда обращайтесь к последней версии руководства по программному обеспечению, если таковая имеется.

Таблица 1: Рабочая смесь шариков для мультиплексного иммуноферментного анализа. После завершения соединения и подтверждения, был подготовлен мастер-микс, состоящий из каждого набора бусин, как показано на рисунке. Мастер-смесь распределялась по всем скважинам в 96-луночной пластине. Все лунки инкубировались со слюной, за исключением одной фоновой контрольной лунки, которая содержала только гранулы и буфер PBS-1% BSA.

Антиген	Набор бусин	Буфер связи	Концентрация Ag (μг)	# бусин в 1 углу	# бус/μl	Объем для 100 Б/мкл для 4 мл (μл)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6,400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7,100	85
Гепатит А	42	MES 5.0	100	91	9,100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8,500	71
Норовирус GII.4	55	MES 5.0	5	72	7,200	83
Норовирус GI.1	67	MES 5.0	5	63	6,300	95
Разъединенный	80	MES 5.0		60	6,000	100
		Общий объем бусин (мкл)				594
		Общий объем необходимого буфера (μл)				3,406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Оборудование и программное обеспечение
Микроцентрифуга	Корпорация «Термоэлектрон	75002446	Используется для центрифугирования образцов
Вихревой смеситель	ВВР	Г560	Используется для смешивания образцов
Ультразвуковой аппарат (мини)	Научный центр Фишера	Телефонный номер 15-337-22	Используется для разделения бусин
Пипетки P10, P20, P100, P1000, 8 вп.	Капулетти	различный
Многоэкранный вакуумный коллектор	Многородность	MSVMHTS00	Используется на этапах мытья для удаления надосадочной жидкости
Микрошейкер	ВВР	12620-926	Используется для взбалтывания бусин во время инкубации
Штатив для пробирок (1,5 мл и 0,5 мл) (ассорти)	ВВР	30128-346 (Английский)
весы	Mettler или другой		Используется для измерения промывочных реагентов для изготовления буферов
Смеситель образцов Dynabead	Инвитроген	947-01	Используется на этапе инкубации муфты
MatLab (R2014b)	Компания MathWorks, Inc.		Используется для анализа данных об ответе антител
Microsoft Excel 2014	Корпорация Microsoft		Используется для анализа данных об ответе антител
Luminex Analyzer с программным обеспечением xPonent 3.1	Корпорация Luminex	ЛХ200-ХПОН3.1	Прибор и программное обеспечение, используемые для проведения анализа
Антигенов
Вирус GI.1 Норуолка: p-частица	Си Цзян (CCHMC)*	NA	* Детская больница Цинциннати. Итоговая конс. 5 мкг.
GII.4 Норовирус VA387: p-частица	Си Цзян (CCHMC)*	NA	* Детская больница Цинциннати. Итоговая конс. 5 мкг.
Вирус гепатита А: концентрат II степени из клеточной культуры	Меридиан Медико-биологические науки	8505	Антиген сопряжен при 100 мкг
Helicobacter pylori : лизат	Меридиан Медико-биологические науки	Р14101	Антиген сопряжен при концентрации 25 мкг
Toxoplasma gondii : рекомбинантный p30 (SAG1)	Меридиан Медико-биологические науки	Р18426	Антиген сопряжен при концентрации 25 мкг
Campylobacter jejuni: тепло убивает целые клетки	КПЛ	50-92-93	Антиген сопряжен при 50 мкг
Первичные антитела
Антиноровирус морской свинки	(КЧМЦ)*	NA	Используется для подтверждения муфты
Мышиный препарат против гепатита А IgG	Меридиан Медико-биологические науки	C65885M	Используется для подтверждения муфты
Мышиный препарат против гепатита А IgG	Меридиан Медико-биологические науки	C65885M	Используется для подтверждения муфты
BacTraceAffinity Очищенное антитело к Helicobacter pylori	КПЛ	01-93-94	Используется для подтверждения муфты
Козий pAb к Toxoplasma gondii	Абкам	АБ23507	Используется для подтверждения муфты
BacTrace Goat анти-кампилобактерные виды	КПЛ	01-92-93	Используется для подтверждения муфты
Вторичные антитела
Биотин-SP-конъюгированный AffiniPure Donkey против козьего IgG (H+L)	джэксон	705-065-149 (Английский	Используется для подтверждения муфты
Биотинилированный кролик против козьего IgG (H+L)	КПЛ	16-13-06	Используется для подтверждения муфты
Биотинилированный козий антимышиный IgG (H+L)	КПЛ	16-18-06	Используется для подтверждения муфты
Affinity Purified Антитела биотина меченые козьи против кролика IgG (H+L)	КПЛ	176-1506	Используется для подтверждения муфты
Affinity Purified Антитела биотина меченые козьи античеловеческие IgG(γ)	КПЛ	16-10-02	Используется для иммуноферментного анализа слюны
Расходные материалы
Микроцентрифужные пробирки на основе сополимера 1,5 мл	США Сайентифик	1415-2500	Используются в качестве микроцентрифужных пробирок с низким связыванием
Стержневые наконечники для пипеток объемом 10 мкл	БиоВенчурс	5030050К
Заправка наконечников для пипеток объемом 200 мкл	БиоВенчурс	5030080К
Заправка наконечников для пипеток объемом 1000 мкл	БиоВенчурс	5130140К
Алюминиевая фольга	Различные поставщики		Используемые держат бусины в темноте во время инкубации
Планшеты для глубоких скважин	ВВР	40002-009	Используется для разбавления образцов слюны
Многоэкранные фильтрующие пластины	Многородность	MABVN1250	Используется для проведения анализов
Система сбора слюны Oracol	Малверн Медикал Девелопментс Лимитед		Используется для сбора слюны
Реагентов
Карбоксилированные микросферы (шарики)	Корпорация Luminex	В зависимости от набора бусин	Антигены связаны с микросферами
EDC (1-этил-3-[3диметиламинопропил] карбодиимида гидрохлорид)	прокалывать	77149 или 22980	Используется при активации бусин
Сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)	прокалывать	No 24510	Используется при активации бусин
Стептавидин-R-фикоэритрин (1 мг/мл)	Молекулярные зонды	С-866	Используется в качестве репортера
MES (2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота)	сигма	М-2933	Используется для муфты
Tween-20 (Полиоксиэтиленорбитан монолаурат)	сигма	П-9416	Используется в буфере для промывки для удаления неспецифических связующих
Белковые буферы
Буфер для блокировки/хранения PBS-TBN (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**			Фильтр: Стерилизуйте и храните при температуре 4°C
PBS, pH 7,4	сигма	П-3813	138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl
БСА	сигма	А-7888	0,1% (по объему)
Подросток-20	сигма	П-9416	0,2% (v/v)
Азид натрия (0,05% азида)**	сигма	С-8032	** Внимание: азид натрия остро токсичен. Избегайте попадания на кожу и в глаза. Носите соответствующие СИЗ. Утилизировать в соответствии с действующим законодательством.
MES/ Буфер для связи (0,05 м MES, pH 5,0)
MES (2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота)	сигма	С-3139
5 Н NaOH	рыбак	СС256-500
Буфер для анализа (PBS, 1% BSA, pH 7,4)			Фильтр: Стерилизуйте и храните при температуре 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7,4	сигма	П-3688	138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1% BSA
Активационный буфер (0,1 М NaH2PO4, pH 6,2)			Фильтр: Стерилизуйте и храните при температуре 4°C
NaH2PO4 (Фосфат натрия, одноосновной безводный)	сигма	С-3139	0,1М NaH2PO4
5 Н NaOH	рыбак	СС256-500
Буфер для промывки (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)			Фильтр: Стерилизуйте и храните при температуре 4°C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4	сигма	П-3563	138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,05% ТВИН