Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Анализ на фагоцитоз
- Инкубировать 2 x 106 лейкоцитов и 4 x 106 меченых FITC конидий (кратность инфекции = 2) в 1,5 мл RPMI + 10% FCS в 12-луночном клеточном культуральном планшете. В качестве контроля включите только клетки (без конидий) и клетки + непомеченные конидии.
- Поместите в увлажненный инкубатор сCO2 при температуре 37 °C и инкубируйте в течение желаемого периода времени (например, 0,5 ч, 2 ч или 4 ч).
- После инкубации соберите клетки с помощью скребка для клеток и поместите в пробирку объемом 15 мл.
- Отжим 5 минут при 300 x g при комнатной температуре.
- Соберите надосадочную жидкость для анализа цитокинов или выбросьте, если в этом нет необходимости. Повторно суспендируйте каждый образец в 100 мкл PBS + 2 мМ ЭДТА.
2. Окрашивание антителами
- Для каждого образца готовят 100 мкл смеси антител, включая антитела APC anti-FITC, согласно таблице 1.
- Поместите образец объемом 100 мкл в одну лунку 96-луночного планшета с V-образным дном. Добавьте 150 μL PBS + 2 mM EDTA для стирки.
- Для цветовой компенсации поместите 1 x 106 ячеек для каждого цвета в дальнейшие лунки 96-луночного V-образного дна. Включите лунку с клетками, которые не должны быть окрашены. Добавьте 150 μL PBS + 2 mM EDTA для стирки.
- Накройте тарелку клейкой пленкой.
- Отжим 5 минут при 300 x g при комнатной температуре. Снимите фольгу.
- Выбросьте надосадочную жидкость, быстро и с усилием перевернув пластину только один раз над раковиной или одноразовым бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повторяйте и не стучите пластину по бумаге до полного высыхания, так как это приведет к значительной потере клеток пластины.
- Ресуспендируйте клетки в смеси антител объемом 100 мкл и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
- Для компенсации цвета ресуспендируйте соответствующие клетки в 100 мкл PBS + 2 мМ ЭДТА и добавьте по одному антителу в каждую лунку в том же количестве, которое используется в смеси антител.
- Накрыть клейкой пленкой и выдерживать 20 минут при комнатной температуре в темноте.
- Снимите фольгу. Добавьте 150 μL PBS + 2 mM EDTA в каждую лунку для промывки. Накройте клейкой пленкой.
- Отжим 5 минут при 300 x g при комнатной температуре. Снимите фольгу. Выбросьте надосадочную жидкость, быстро и с усилием перевернув тарелку над раковиной или одноразовым бумажным полотенцем.
- Ресуспендируйте в 200 мкл PBS + 2 мМ ЭДТА и перенесите ячейки из каждой лунки в отдельную трубку с круглым дном. Убедитесь, что в суспензии нет скоплений клеток. В противном случае удалите кластеры.
Примечание: Каждый кластер, достаточно большой, чтобы его мог увидеть глаз, достаточно велик, чтобы потенциально засорить цитометр.
3. Проточная цитометрия
- Запустите проточный цитометр и дайте ему нагреться. Запустите программное обеспечение для сбора данных.
- Создайте новый эксперимент, настройте и пометьте образцы.
- Настройка параметров (FSC 250, SSC 250) и детекторов для флуорофоров FITC, APC, BUV395, V500 и PerCP-Cy5.5.
- Настройка компенсации
- Откройте настройку компенсации.
- Укажите отдельные цвета.
- Используя контрольные ячейки, оставленные неокрашенными, или с отдельными пятнами, настройте напряжение детектора ФЭУ так, чтобы оно включало все события в пределах шкалы.
- Запишите не менее 10 000 событий каждого элемента управления.
- Используйте настройку компенсации для вычисления перетока флуорофоров и примените ее к настройкам цитометра эксперимента.
- Запись образцов данных
- Отобразите FSC и SSC в программном обеспечении для сбора данных и установите ворота вокруг лейкоцитов.
- На основе лейкоцитарного вентиля отображается точечная диаграмма SSC/CD45 и вентиль для отделения CD45+ клеток от конидий.
- Отобразите клетки CD45+ в виде точечной диаграммы CD14/CD66b и зарегистрируйте моноциты (CD14+) и нейтрофилы (CD66b+) отдельно.
- Отображение нейтрофилов в виде точечной диаграммы анти-FITC/FITC.
- Используя образец с немечеными конидиями, установите квадранты для сигналов анти-FITC и FITC, допуская максимум 1% клеток в соответствующих квадрантах.
- Повторите шаги 3.5.4 и 3.5.5 для моноцитарных ворот.
- Запишите все образцы, содержащие не менее 20 000 событий в лейкоцитарном затворе.
Таблица 1: Смесь антител для проточной цитометрии. Количество каждого реагента указывается в микролитрах на анализируемый образец (1 x 106 клеток).
| реагент | мкл на пробу |
| КД45 БУВ395 | 1 |
| КД14 В500 | 0,5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1.5 |
| анти-FITC APC | 0,5 |
| PBS + 2 мМ ЭДТА | 97 |
| итог | 100 |
