Иммунофлуоресцентный анализ для характеристики и количественного определения стрессовых гранул млекопитающих

Аннотация

Источник: Aulas, A. et al., Методы классификации цитоплазматических очагов как стрессовых гранул млекопитающих.J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует анализ для характеристики и количественного определения стрессовых гранул млекопитающих, которые состоят из мРНК, РНК-связывающих белков (RBP) и различных других белков.

Протокол

1. Подготовка клеток

1. Добавьте автоклавные покровные стекла в 12 лунок 24-луночного планшета, как показано на рисунке 1А; это можно сделать с помощью стерильной пастерной пипетки, прикрепленной к вакууму, чтобы захватить каждую защитную пластинку. Осторожно постучите покровным стеклом по боковой стороне колодца, чтобы выпустить всасывание, позволив покровному стекло упасть в колодец.
2. Планшет 1 x 10⁵ U-2 OS (U2OS) клеток остеосаркомы в лунку с конечным объемом 500 мкл среды. Перемещайте пластину из стороны в сторону, вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек.
3. Аккуратно прижмите покровные стекла чистым наконечником P1000, чтобы убедиться, что покровное стекло находится на дне колодца и под ним нет пузырей.

2. Стрессовые клетки

1. На следующий день визуально проверьте планшет, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены и равномерно сливаются по покровному стеклу, так как различия между образцами могут отрицательно повлиять на воспроизводимость результатов. Используйте объектив с 10-кратным увеличением на инвертированном тканевом микроскопе.
2. Нагрейте среду до 37 °C. Избегайте нанесения холодных или горячих сред на элементы, так как они вызывают холодовой шок или тепловой шок соответственно.
3. Разведите препараты в предварительно подогретых средах. Для каждой разной концентрации препарата готовят 2 лунки, содержащие 500 мкл среды. Приготовьте еще 500 μл, чтобы учесть потери при пипетировании. Аликвота 4 пробирки, каждая по 1,5 мл.
   1. Для арсенита натрия: в каждую лунку, содержащую 500 мкл, добавить 1,5 мкл 100 мМ арсенита натрия (конечная концентрация: 100 мкМ) или добавить 0,75 мкл 100 мМ арсенита натрия (конечная концентрация: 50 мкМ).
   2. Для винорелбина: в каждую лунку, содержащую 500 мкл, добавить 22,5 мкл 10 мМ винорелбина (конечная концентрация: 150 мкМ) или 18,75 мкл 10 мМ винорелбина (конечная концентрация: 100 мкМ).<бр/> заметка: Арсенит натрия является хорошо охарактеризованным и широко используемым индуктором гранул напряжения и поэтому классически используется в качестве положительного контроля.
4. Удалите и выбросьте фильтрующий материал из лунок В1 - 4 и С1 - 4. Добавьте среду с препаратами и подождите 60 минут (рисунок 1А).
   1. Добавьте 500 мкл среды со 100 мкМ арсенитом натрия в лунки В1 и В2. Добавьте 500 мкл среды с 50 мкМ арсенитом натрия в лунки В3 и В4.
   2. Добавьте 500 мкл среды со 150 мкМ винорелбином в лунки С1 и С2. Добавьте 500 мкл среды со 125 мкМ винорелбином в лунки С3 и С4.
5. За 30 мин до фиксации обработать лунки в колонне 2 5 мкл циклогексимида (запас 1 мг/мл) и лунки в столбце 4 2 мкл пуромицина (запас 1,25 мг/мл). Осторожно покачивайте пластину для перемешивания, прежде чем поместить ее обратно в инкубатор при температуре 37 °C.

3. Фиксация клеток и иммунофлюоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом убедитесь, что метанол охлажден до -20 °C. Сделайте буферы, включая фосфатно-солевой буфер (PBS), 5% нормальной лошадиной сыворотки (NHS) в PBS и 4% параформальдегид (PFA) в PBS.

1. Выбросьте фильтрующий материал и промойте лунки, содержащие покровные стекла, PBS. В зависимости от используемых препаратов может быть важно правильно отказаться от препаратов, содержащих среду; Обратитесь в местное управление по охране окружающей среды для получения конкретных инструкций. Чтобы эффективно промыть, наполните бутылку PBS, отрежьте кончик, чтобы обеспечить мягкий поток, а не узкий поток, и используйте его для добавления PBS в каждую лунку после аспирации исходного PBS.
2. Зафиксируйте ячейки с помощью ~250 мкл 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре, RT при осторожном перемешивании. Полностью покройте верхнюю часть покровного стекла PFA; 250 мкл должно быть достаточно, но если нет, добавьте больше. Всегда избегайте пипетирования непосредственно на покровных стеклах, так как некоторые клетки (или стрессовая обработка клеток) могут изменить прикрепление, и сила пипетирования может сместить клетки.
3. Извлеките PFA и утилизируйте должным образом. Свяжитесь с местным отделом экологической безопасности для получения подробной информации о том, как правильно выбрасывать параформальдегид.
4. Добавьте ~250 μL метанола (-20 °C) и инкубируйте в течение 5 минут при RT под легким покачиванием; это пропитывает и сплющивает клетки.
5. Удалите и выбросьте метанол и заблокируйте ячейки, внося ~250 μL 5% NHS в течение 1 часа при RT на ночь, O/N, при 4 °C. Свяжитесь с местным отделом экологической безопасности для получения подробной информации о том, как правильно выбрасывать метанол.
6. Для первичных антител разбавьте антитела в 5% NHS.
   заметка: Использование нескольких маркеров SG является ключом к подтверждению того, являются ли наблюдаемые гранулы добросовестными SG. Количество SG-маркеров, которые можно использовать, зависит от фильтров, имеющихся в микроскопе. Если доступны стандартные наборы фильтров зеленого, красного и дальнего красного цвета, используйте G3BP1, eIF4G и eIF3b в разведении 1/250.
   1. Для этого эксперимента (12 покровных стекол по 250 мкл каждый-Всего: 3 мл 5% NHS) добавьте по 12 мкл каждого из следующих веществ: anti-G3BP1, anti-eIF3b и anti-eIF4G. Первичные антитела инкубируют с помощью осторожного перемешивания в течение не менее 1 ч при RT или O/N при 4 °C.
7. Промойте лунки 3 раза PBS и инкубируйте каждую промывку в течение 5 минут.
8. Для вторичных антител разбавьте все вторичные антитела (разведение 1/250) и краситель Хёхста (разведение 1/1000) в 5% NHS.
   1. Для этого эксперимента (12 покровных листов по 250 мкл каждый-всего: 3 мл 5% NHS) добавьте по 12 мкл каждого из следующих веществ: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit и Cy5-Goat (в разведении 1/250 каждого) и добавьте 3 мкл красителя Hoechst.
   2. Инкубировать покровные стекла со вторичными антителами в течение 1 ч в режиме ЛТ. Во время этого и последующих этапов защищайте образцы от света, накрыв планшет коробкой или поместив фольгу поверх чашки для культуры тканей.
9. Промойте лунки три раза PBS по 5 мин каждая.
10. Закрепите покровные стекла на стеклянных предметных стеклах с маркировкой с помощью монтажного носителя. Нагрейте монтажный материал в термоблоке при температуре 37 °C в течение 10 минут; Это снижает вязкость и облегчает пипетирование. С помощью разрезанного наконечника P200 нанесите 25 μL монтажного материала на покровное стекло на предметное стекло; На одном предметном стекле может поместиться 4-8 покровных стекол, при условии, что предметный столик микроскопа это позволяет. С помощью тонких щипцов перенесите покровное стекло из лунки на предметное стекло, убедившись, что ячейка лежит на монтажной среде. С помощью чистого наконечника P200 нажмите на защитное стекло
.
11. После того, как все покровные стекла будут установлены, используйте сложенную лабораторную салфетку, чтобы очистить излишки монтажной среды, очень плотно прижав лабораторную салфетку к предметному стеколу. Используйте отжимную бутылку, содержащую H₂O, чтобы смыть излишки монтажной среды, а затем повторите промокание сложенной лабораторной салфеткой, чтобы удалить воду.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальные диаграммы. (А) Затравочные ячейки на покровных стеклах, ранее помещенных в 24-луночный планшет, как показано на рисунке. Обрабатывайте ряды A и B в течение 60 минут SA или VRB, используя концентрацию в μM в соответствии с указаниями. Через 60 мин в лекарствосодержащую среду добавить CHX (конечная концентрация: 20 мкг/мл для колонки 2) или puro (20 мкг/мл ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ОС У-2	АТКС	АТКС®ХТБ-96™	- обычно пишется как "U2OS" - посев при 37 °C при 5% CO2 в 10% FBS/DMEM
Модификация Дульбекко Eagle's Medium	Корнинг	10-013-СВ	- сокращенно DMEM - содержит 4,5 г/л глюкозы, пирувата и фенола ред<бр/> - Добавки 10% FBS, 10 mM HEPES и пенициллин/стептомицин - предварительное разведение предварительного препарата(ов) - предварительное разведение препарата (препаратов)
Фетальная бычья сыворотка	сигма	F2442-500мл	- сокращенно FBS - используется в качестве дополнения к средствам массовой информации
ГЕПЕС (1 М)	Thermo Fisher Scientific	15630-080 (Английский)	- используется в качестве дополнения к средствам массовой информации
Пенициллин стрептомицин	сигма	П0781-100мл	- используется в качестве дополнения к средствам массовой информации
24-луночный планшет	Костар	No 3524
Лабораторные салфетки	НАУКА KIMTECH	No 34120 (Английский	- обычно называемые «кимвайпы»
Покровное стекло для растительных покровных стекол	Научный центр Фишера	Тел.: 12-545-82	- Автоклавирование перед использованием - хранить стерильность в капюшоне для культуры тканей
Натрия (мета)арсенит ≥90%	сигма	С7400-100Г	- обычно называется арсенитом натрия и сокращенно SA - растворение в воде при концентрации 1 М, затем разбавление до 100 мкМ в качестве рабочего тела
Винорелбин	ТСЗ ХИМ	РС055	- сокращенно VRB - растворить в воде до 10 мМ
Пуромицин	сигма	П9620	- используется для оценки уровня трансляции (рибопуромицилирования) - используется для оценки соединения SG с активным трансляцией - развести в воде до 10 мг/мл
Гидрат дигидрохлорида эметина	сигма	Е2375	- используется в сочетании с puro для оценки общего уровня перевода - используется для оценки соединения SG с активным трансляцией - развести в воде до 10 мг/мл
Циклогексимид	сигма	С4859	- сокращенно CHX - используется для оценки соединения SG с активным трансляцией - развести в воде до 10 мг/мл
Фосфатно-солевой буфер	Лонза / VWR	95042-486	- сокращенно PBS - промывочный буфер для иммунофлюоресценции
Реагент марки параформальдегида, кристаллический	сигма	П6148-500Г	- в вытяжной шкаф вносят 4% раствор в горячий PBS, размешивают до растворения - аликвоты могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев<бр/> - опасные, используйте вентиляцию - сбросить в специальные отходы
Метанол, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- предварительно охлажденный до -20°C перед использованием - сбросить в специальные отходы
Обычная сыворотка для лошадей	Thermo Fisher Scientific	No 31874	- сокращенно NHS - разбавить до 5% в PBS - добавить азид натрия для хранения при температуре 4°C - блокирующий раствор для иммунофлюоресценции
Этанол, чистый, 200 proof (100%), USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- разбавить до 70% водой
Предметные стекла для микроскопа Fisherbrand Superfrost Plus	Фишербранд	Телефонный номер 12-550-15
Мышиное антитело к G3BP1 (TT-Y)	Санта-Крус	СК-81940	- хранить при температуре 4 °C - использовать в разведении 1/100
Антитела кролика к eIF4G (H-300)	Санта-Крус	СК-11373	- хранить при температуре 4 °C - Разведение 1/250
Антитела козы к eIF3η (N-20)	Санта-Крус	СК-16377	- eIF3η также известен как eIF3b - хранить при температуре 4 °C - Разведение 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	715-225-150 (Английский)	- Восстановите в воде в соответствии с инструкциями производителя, затем храните при температуре 4°C - Разведение 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	711-165-152	- Восстановите в воде в соответствии с инструкциями производителя, затем храните при температуре 4°C - Разведение 1/2500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	705-175-147 (Английский)	- Восстановите в воде в соответствии с инструкциями производителя, затем храните при температуре 4°C - Разведение 1/250
Решение Hoechst 33258	сигма	94403-1МЛ	- инкубировать со вторичными антителами - стоковый раствор 0,5 мг/мл в dH20, беречь от света - хранить при температуре 4 °C
20 x буфер SSC	Термофишер Ambion	АМ9763	- разбавить до 2X SSC с использованием воды, не содержащей РНКазы (обработанной DEPC) - хранить при комнатной температуре - промывочный буфер для FISH
Скользящий монтажный носитель	Домашнее изготовление	/	- смешать 5 г "холодорастворимого" поли(винилового спирта) с 20 мл PBS- смешать ультразвуком, затем перемешать в течение ночи при RT- добавить 5 мл глицерина и 0,2 мл 20% азида натрия и перемешать в течение 16 часов на RT-центрифугировании при 20 000 г в течение 20 минут, выбросить крупные гранулы-аликвотную вязкую жидкость, длительное хранение при -20°С, 1 неделя при 4°С
Парафильм "М"	сигма	П7793-1ЭА	- обычно упоминается как «парафильм»
Поли(виниловый спирт)	сигма	-8136-250Г	- реагент для получения винола
глицерин	сигма	Г5516-100МЛ	- реагент для получения винола
Азид натрия	Научный центр Фишера	С2002-5Г	- Консервант для блокировки раствора и винол<бр/> - сделать 20% разведение в воде

) T