Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка к анализу
- Соберите, подготовьте и систематизируйте материалы, указанные для процедуры (см. Таблицу конкретных материалов/оборудования).
- Этикетка 12 x 75 мм туб.
- Промаркируйте две пробирки для каждого участника: одну пробирку для анализа фагоцитоза (пометьте эту пробирку черными чернилами и буквой «F» для флуоресцеина изотиоцианата [FITC]) и одну пробирку для анализа активности окислительного взрыва (OB) (пометьте эту пробирку красными чернилами и буквой «H» для дигидроэтидия [HE]).
заметка: Рекомендуется использовать стерильные пробирки размером 12 x 75 мм, чтобы свести к минимуму непреднамеренную клеточную активацию и связанное с ней увеличение фонового шума.
- Промаркируйте три пробирки для контрольного анализа: одну пробирку для анализа на фагоцитоз (контроль FITC: пометьте эту пробирку черными чернилами и буквой «F»), одну пробирку для анализа активности OB (контроль HE: пометьте эту пробирку красными чернилами и буквой «H») и одну пробирку для отрицательного контроля (Только кровь: пометьте эту пробирку зелеными чернилами и надписью «только кровь»).
- Готовьте исходные растворы не менее чем за сутки до дня проведения пробы.
- Приготовьте стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS). Разбавьте 100 мл 10x PBS с 900 мл 18,2 МОм H2O. Фильтр простерилизовать фильтром 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте стерильную глюкозу PBS. Растворите 1,0 г глюкозы в 100 мл PBS. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте стерильный 0,1 М цитратный буфер. Растворите 1,2 г лимонной кислоты и 1,1 г цитрата натрия в 100 мл 18,2 МОм H2O. Отрегулируйте pH до 4,0. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте стоковый раствор HE. Ресуспендируйте 1,0 мг HE в 1,0 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Аккуратно перемешайте и храните при температуре -20 °C до использования.
- Приготовьте меченный FITC исходный раствор Staphylococcus aureus (S. aureus) (2 x 109 частиц/мл). Ресуспендируйте 10 мг меченого ФИТК S. aureus в 1,5 мл (или соответствующем количестве) PBS. Разделить на три аликвоты по 500 мкл и обработать ультразвуком в соответствии с рекомендацией производителя. Аликвоту и хранить при температуре -20 °C до использования.
- Приготовьте немаркированный стоковый раствор S. aureus (2 x 109 частиц/мл). Ресуспендируйте 100 мг немеченого S. aureus в 15 мл (или в соответствующем количестве) PBS. Разделить на тридцать 500 мкл аликвот и обработать ультразвуком в соответствии с рекомендацией производителя. Аликвоту и хранить при температуре -20 °C до использования.
- Приготовьте свежие рабочие растворы в день проведения пробы.
- Приготовьте рабочий раствор HE. Переведите 10 мкл талого стокового раствора HE в 990 мкл PBS-глюкозы. Беречь от света и держать на льду до использования.
- Приготовьте меченный FITC рабочий раствор S. aureus (133,333 частиц/мкл). Перелейте 70 мкл размороженного стокового раствора S. aureus, меченного FITC, в 980 мкл PBS. Беречь от света и держать на льду до использования.
- Приготовьте немаркированный рабочий раствор S. aureus (133,333 частиц/мкл). Перелейте 70 мкл размороженного немаркированного стокового раствора S. aureus в 980 мкл PBS. Беречь от света и держать на льду до использования.
- Приготовьте закалочный раствор. Добавьте 750 мкл 0,4% раствора трипанового синего в 11,25 мл стерильного 0,1 М цитратного буфера. Держать на бане с ледяной водой до использования.
- Попросите сертифицированного флеботомиста взять кровь у забора крови в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения по забору крови.
- Наберите кровь в одну пробирку для сбора крови объемом 4 мл, содержащую дикалий этилендиаминтетрауксусную кислоту (K2EDTA). Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями производителя. Держите пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольной коромысле до использования. Используйте эту кровь для общего анализа крови (ОАК) с дифференциальным анализом лейкоцитов (WBC), описанным в Шаге 1.2.1.
- Наберите кровь в одну пробирку для сбора крови объемом 4 мл, содержащую гепарин лития. Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями производителя. Держите пробирку для сбора крови при комнатной температуре (RT) на настольной качалке до использования. Используйте эту кровь для анализа фагоцитоза моноцитов и гранулоцитов и OB-активности, описанного в Шаге 2.
- Определите количество бактерий (т.е. S. aureus), которые потребуются для завершения анализа для каждого образца.
- Используйте гематологический анализатор для проведения общего анализа крови с дифференциальным анализом лейкоцитов на крови, как описано в инструкциях производителя. Обратите внимание на количество лейкоцитов (в клетках/мл), % нейтрофилов и % моноцитов.
- Используйте приведенные ниже уравнения для определения количества нейтрофилов и моноцитов для каждого образца.
Количество нейтрофилов (в клетках/мл) = %Нейтрофилы × лейкоцитах (в клетках/мл)
Количество моноцитов (в клетках/мл) = % моноцитов × лейкоцитов (в клетках/мл)
- Используйте приведенные ниже уравнения для определения количества фагоцитов для каждого образца и количества фагоцитов, присутствующих в 100 μл образца.
Количество фагоцитов (в клетках/мл) = количество нейтрофилов (в клетках/мл) + количество моноцитов (в клетках/мл)
Количество фагоцитов в 100 мкл = (Количество фагоцитов (в клетках/мл)))/10
- Используйте приведенное ниже уравнение, чтобы определить количество бактерий (т.е. S. aureus), необходимое для каждого образца, и количество меченого FITC рабочего раствора S. aureus или немеченного рабочего раствора S. aureus (133,333 частиц/мл), которое следует добавить в каждую пробирку.
заметка: Целевое соотношение бактерий и фагоцитов составляет 8:1,
Необходимое количество бактерий = Количество фагоцитов в 100 мкл × 8
Необходимый объем FITC или немаркированного рабочего раствора (в μл) = (количество необходимых бактерий)/(133,333 частиц/μл)
2. Выполните анализ
- Подготовьте цельную кровь для анализа.
- Для каждого участника и контрольной пробирки используйте наконечник пипетки увеличенной длины, чтобы перенести 100 мкл цельной крови из пробирки для сбора крови с гепарином лития на дно пробирки с соответствующей маркировкой размером 12 x 75 мм. Замените колпачки.
заметка: Будьте осторожны, чтобы кровь не попала на боковые стороны трубок размером 12 x 75 мм.
- С помощью микропипетки добавьте 10 μл рабочего раствора HE в пробирки, помеченные красными чернилами и буквой «H», включая контрольную трубку HE. Ненадолго замените колпачки и вортекс.
- Инкубируйте все пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут. Затем немедленно перенесите все трубки в ванну с ледяной водой на 12 мин. <бр/>
заметка: Используйте открытую металлическую решетку и осторожно встряхивайте ее каждые 5 минут, чтобы пробирки быстро и адекватно нагрелись или охладились.
- Добавьте бактерии (например, S. aureus) в образец и контрольные трубки.
- С помощью микропипетки добавьте соответствующее количество (рассчитанное в шаге 1.2.4) немаркированного рабочего раствора S. aureus в пробирки, помеченные красными чернилами и буквой «H», включая контрольную трубку HE. Ненадолго замените колпачки и вортекс.
- С помощью микропипетки добавьте соответствующее количество (рассчитанное в шаге 1.2.4) рабочего раствора S. aureus с маркировкой FITC в пробирки, помеченные черными чернилами и буквой «F», включая контрольную трубку FITC. Ненадолго замените колпачки и вортекс.
- Сделайте вихревой контур контрольной трубки «только кровь», но не добавляйте в нее ни один из видов бактерий (например, S. aureus).
- Инкубируйте все пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 мин. Используйте открытую металлическую решетку и осторожно встряхивайте ее каждые 5 мин, чтобы пробирки быстро и адекватно нагрелись. После инкубационного периода немедленно переведите все трубки на ванну с ледяной водой на 1 мин.
- Промойте клетки.
- С помощью пипетки-репитера добавьте 100 μл ледяного раствора для закалки во все пробирки. Установите крышки на место, кратковременно похлопайте, а затем инкубируйте все пробирки на льду в течение 1 минуты.
- С помощью пипетки-репитера добавьте 1 мл ледяного PBS во все пробирки. Ненадолго перемешайте, а затем добавьте во все пробирки дополнительно 2 мл ледяного PBS и замените крышки. Центрифугируйте все пробирки в течение 5 мин при 4 °C и 270 x g, а затем отаскуйте надосадочную жидкость.
- Повторите шаг 2.3.2 один раз (всего 2 стирки).
- Подготовьте образцы для проточной цитометрии.
- С помощью пипетки-репитера добавьте 50 мкл ледяной эмбриональной бычьей сыворотки во все пробирки. Кратковременно закрутите все трубки.
- Перенесите все пробирки в соответствующую карусель и используйте автоматизированную рабочую станцию для приготовления лизиса клеток с лизингом эритроцитов (эритроцитов) и реагентами, фиксирующими лейкоциты, для лизирования эритроцитов и фиксации лейкоцитов, как описано в инструкции производителя.
