Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Экспериментальная установка
- Используйте листы фильтровальной бумаги (волокнистые листы гидроксилированного полиэстера, см. Таблицу материалов).
- Вырежьте полоски размером 3 х 15 мм для ребенка 1 месяца и Г-образной формы для детей постарше и взрослых (5 х 20 х 10 мм (короткий кронштейн Л)).
- Вставьте по одному листу фильтровальной бумаги в каждую ноздрю младенца с помощью щипцов. Поместите фильтровальную бумагу в переднюю часть нижней носовой раковины (примерно 1 см внутри ноздри для новорожденных и 1,5 см для всех остальных возрастов).
- Уложите новорожденных на кровать и дайте им сахарную воду для комфорта.
заметка: Для детей всех остальных возрастов отбор проб проще всего выполнить, сидя на стуле.
- Для детей постарше вставьте длинный рукав L-образной фильтровальной бумаги в каждую ноздрю.
- Наложите носовой зажим вокруг ноздрей, чтобы свести к минимуму дискомфорт и избежать случайной потери фильтровальной бумаги.
- Удалите фильтровальную бумагу через 2 минуты после впитывания.
- Поместите фильтровальную бумагу в пробирки с маркировкой и немедленно заморозьте ее при температуре -80 °C.
- Запишите любые симптомы инфекции дыхательных путей, проявленные у ребенка в день забора пробы.
- Записывайте любое чихание, настойчивый плач или носовое кровотечение, возникающие в течение 2 минут отбора проб.
2. Количественная оценка иммуномедиаторов дыхательных путей
- Возьмите до 10 случайных образцов из морозилки. Запишите идентификационные номера. Держите образцы на льду в течение всего рабочего процесса.
- После размораживания на льду погрузите фильтровальную бумагу (для каждого субъекта) из обеих ноздрей в 300 мкл свежеприготовленного буфера (см. Таблицу материалов), содержащего одну полную таблетку ингибитора протеазы (см. Таблицу материалов) на 25 мл буфера.
- Отрегулируйте объем буфера в соответствии с размером фильтровальной бумаги.
- Используйте 300 мкл буфера для фильтровальной бумаги размером 3 x 15 мм.
- Если доступна только одна фильтровальная бумага, используйте вдвое меньший объем буфера (150 μл).
- Перенесите образцы в шейкер для тарелок (400 об/мин) на 5 мин. Используйте таймер.
- Переложите влажную фильтровальную бумагу и буфер для анализа в чашку фильтра из ацетата целлюлозы (размер пор 0,22 мкм), помещенного в микроцентрифужную пробирку (см. Таблицу материалов).
- Центрифугируйте при 16 000 x g в течение 5 мин в охлажденной центрифуге (при 4 °C) для получения отфильтрованного назального экстракта в пробирке.
- Снимите чашку и держите трубки на льду, одновременно закапывая назальный экстракт в лунки пластин для хранения с низким содержанием белка (см. Таблицу материалов).
- Хранить при температуре -80 °C до анализа.
- Определение концентраций цитокинов и хемокинов в назальных экстрактах с помощью высокочувствительной мультиплексной матричной системы на основе электрохемилюминесценции (см. Таблицу материалов).
В: Здесь были проведены человеческий 10-плексный анализ цитокинов TH1/TH2, 9-плексный хемокиновый анализ, а также одноплексный интерлейкин-17А (IL-17A), трансформирующий фактор роста-бета1 (TGF-β1) и стромальный лимфопоэтин тимуса (TSLP).
- Для проведения анализов назальные экстракты инкубируют в течение ночи при температуре 4 °C. Проводите измерения в соответствии со стандартным протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
заметка: Иммунологические анализы (см. Таблицу материалов) обычно имеют широкий динамический диапазон для измерения в диапазоне от 1 до 10 000 пг/мл, но для некоторых анализов он может составлять 100 000 пг/мл. Это означает, что все образцы могут быть обработаны при одном и том же разведении, что ограничивает влияние разнородных разведений на здоровых и больных субъектов, как это имеет место в других подобных иммунологических анализах. Нижний предел обнаружения для всех цитокинов составлял 1 пг/мл или менее, а для хемокинов он колебался от 1 до 50 пг/мл. TSLP не обнаруживался в 98% образцов в возрасте 1 месяца.
