Анализ расщепления флюорогенных пептидов для скрининга протеолитической активности протеаз

Аннотация

Источник: Jaimes, J. A., et al. Анализ расщепления флуорогенных пептидов для скрининга протеолитической активности: Приложения для активации шиповидного белка коронавируса. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует анализ для скрининга протеолитической активности протеаз с использованием флюорогенных пептидов. Протеаза распознает место своего расщепления на пептиде, расщепляя его и отделяя гаситель от флуорофора, обеспечивая его флуоресцентное излучение. Сигнал флуоресценции обнаруживается и анализируется для проверки эффективности расщепления различных вариантов пептидов.

Протокол

1. Проектирование и подготовка пептидов

1. Получите интересующую вас последовательность гибридного белка из общедоступной базы данных, такой как NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) или база данных вирусных патогенов (https://www.viprbrc.org). Выберите сайт узнавания протеазы, предшествующий пептиду слияния, и включите в него 2-3 аминокислоты до и после этой последовательности.
2. При заказе пептидов модифицируйте их с помощью пары FRET 7-метоксикумарин-4-илацетил (MCA) на N-конце и N-2,4-динитрофенил (DNP) на C-конце.
   заметка: Некоторые поставщики предоставляют эти модификации. Цена и сроки поставки зависят от ....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пептиды	Биоматик	Н/Д
Фурин	клюв	П8077С
Трипсин, обработанный TPCK	Сигма-Олдрич	4352157-1КТ
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н3375
CaCl2	Сигма-Олдрич	С1016
2-Меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	М6250
Тритон-Х100	Сигма-Олдрич	Х100
ПБС	Корнинг	21-040-ЧВ
SpectraMax Gemini XPS	Молекулярные приборы	XPS
СофтМакс Про 6.5.1	Молекулярные приборы	Н/Д
96-луночная пластина (твердый черный полистирол с плоским дном и необработанный)	Костар	No 3915
Легкие демпфирующие трубки	Лаборатория Watson	131-915BL или 131-915BR