$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Проектирование и подготовка пептидов
- Получите интересующую вас последовательность гибридного белка из общедоступной базы данных, такой как NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) или база данных вирусных патогенов (https://www.viprbrc.org). Выберите сайт узнавания протеазы, предшествующий пептиду слияния, и включите в него 2-3 аминокислоты до и после этой последовательности.
- При заказе пептидов модифицируйте их с помощью пары FRET 7-метоксикумарин-4-илацетил (MCA) на N-конце и N-2,4-динитрофенил (DNP) на C-конце.
заметка: Некоторые поставщики предоставляют эти модификации. Цена и сроки поставки зависят от выбранного поставщика. Тем не менее, существуют альтернативные модификации, которые различаются по чувствительности и требуют регулировки считывателя пластин с точки зрения длин волн.
- Ресуспендируйте пептид в соответствии с рекомендациями производителя, аккуратно пипетируя его вверх и вниз. Например, ресуспендировать пептиды в 70% этаноле до конечной концентрации 1 мМ.
- По желанию добавьте пробирку, содержащую пептид и растворитель, в ванну с ультразвуком до тех пор, пока она полностью не ресуспендируется, если пептид не очень хорошо ресуспендируется при пипетировании.
- Поместите пептид в светогасящие или устойчивые пробирки, чтобы защитить пептид от отбеливания. Держите аликвоты небольшими, чтобы избежать многократных циклов замораживания/размораживания (например, 100 μл). Хранить аликвоты при температуре -20°С.
2. Подготовка считывателя флуоресцентных пластин
- Включите считыватель пластин и дождитесь завершения самопроверки.
- Откройте операционное программное обеспечение на подключенном компьютере и убедитесь, что оно подключено к считывателю пластин.
- Откройте настройку температуры и установите ее на 30 °C (или на температуру, необходимую для оптимальной производительности протеазы).
- Нажмите на Управление | Instrument Setup для организации эксперимента.
- Выберите Kinetic.
- Выберите Флуоресценция.
- Введите длины волн возбуждения и излучения: 330 нм и 390 нм соответственно.
- Снимите флажок «Автоматическое отключение».
- Выберите Средняя, нормальная чувствительность.
- Выберите время выполнения анализа 1 час и выберите одно измерение каждые 60 с.
- Установите перемешивание за 5 секунд до первого измерения и за 3 секунды до каждого измерения
- Выберите лунки для чтения и начните анализ.
3. Подготовка к анализу
- Подготовьте буфер для анализа, рассчитав соответствующие количества для каждого ингредиента и добавив его. Для фурина делают буфер, состоящий из 100 мМ HEPES, 1 мМ CaCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 5% Triton X-100. Для получения трипсина используйте стандартный фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
заметка: Достаточно объемов не более 10 мл. В зависимости от протеазы, используемой в анализе, буфер варьируется.
- Охладите буфер на льду.
- Положите пробную пластину на лед, опустив под нее тонкую металлическую пластину для поддержания охлаждения и стабильности. Используйте твердый черный полистирольный 96-луночный планшет с плоским дном и необработанный.
заметка: Важно использовать черные пластины, чтобы предотвратить флуоресцентную «утечку» из соседних скважин.
- Рассчитайте подходящее количество протеазы, которое следует добавить для каждой реакции, основываясь на предыдущих публикациях или экспериментальных данных. Для фурина используйте 1 единицу на реакцию, что соответствует 0,5 μл. Для получения трипсина используйте 0,5 мкл 160 нМ трипсина TPCK.
- Для каждого образца готовят 3 технические реплики на пробу в общем объеме 100 мкл на образец.
заметка: Экспериментально было оценено, что нет никакой разницы, проводится ли пипетирование при нормальном освещении или при приглушенном свете. Однако пептиды не должны подвергаться воздействию света в течение длительного периода времени.
- Пипеткой нанесите соответствующее количество буфера для анализа (94,5 μл, как описано в шаге 3.1) в каждую лунку.
- Добавьте протеазу в каждую лунку. Для фурина и трипсина TPCK используйте 0,5 мкл на образец. В 6 лунок (3 лунки для холостого контроля и 3 лунки для пептидного контроля) добавьте 0,5 мкл буфера вместо соответствующей протеазы.
- Добавьте пептид до конечной концентрации 50 мкМ в каждую лунку, кроме контрольной лунки. В этом случае пипетку 5 мкл пептида готовили, как описано в Шаге 1.3. Добавьте 5 мкл буфера в пустой контроль вместо пептида.
заметка: Несколько концентраций пептида были первоначально протестированы с описанными концентрациями ферментов, чтобы убедиться, что ферменты насыщены.
- Вставьте пластину в считыватель флуоресцентных пластин и нажмите «Пуск».