Мониторинг поступления помеченных GFP поверхностных белков в сеть Транс-Гольджи с использованием функционализированных нанотел

Аннотация

Источник: Buser, D. P., et al. Анализ эндоцитарного поглощения и ретроградного транспорта в транс-сеть Гольджи с использованием функционализированных нанотел в культивируемых клетках. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует метод изучения поглощения и ретроградного транспорта функционализированных нанотел для понимания их внутриклеточных путей переноса. Благодаря введению радиоактивно меченого сульфата и использованию методов выделения и детекции, этот метод позволяет изучать эндоцитарное поглощение и прибытие белков-грузов через сеть Гольджи.

Протокол

1. Поглощение функционализированных нанотел культивируемыми клетками (для анализа сульфатации)

1. В колпаке для клеточных культур семена ~400 000 - 500 000 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих помеченный GFP репортерный белок, в чашках диаметром 35 мм или на 6-луночных кластерах с полной средой, содержащей антибиотики (среда Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, дополненная 10% эмбриональной сывороткой теленка (FCS), 100 единицами/мл стрептомицина, 2 мМ l-глутамина и 1,5 μг/мл пуромицина).
   заметка: Как упоминалось выше, в качестве иллюстрации мы используем клетки HeLa, стабильно экспрессирующие EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR и TfR-EGFP. Помимо стабильных клеточных линий, можно использовать также транзиторно трансфицированный HeLa.
2. Инкубируйте клетки O/N при 37 °C в инкубаторе с содержанием_CO2 7,5% для размножения.
   заметка: На следующий день слияние клеток должно составлять ~80%.
3. Удалите всю среду, промойте 2 раза 1x PBS в RT и заморите клетки бессульфатной средой (SFM) в течение 1 часа при 37 °C в инкубаторе с 7,5%_CO2><. заметка: SFM получают путем добавления 10 мл раствора аминокислот MEM (50x), 5 мл L-глутамина (200 mM), 5 мл витаминного раствора (100x) и 900 мкл CaCl₂·2H₂O к 500 мл сбалансированных солей Eagle's. Пропустите через фильтр 0,22 мкм и аликвотуйте.
4. В вентилируемом колпаке или стенде, предназначенном для работы с радиоактивностью, приготовьте сульфатную среду для мечения, содержащую 0,5 мКи/мл [³⁵S] сульфата в виде натриевой соли в SFM.
   осторожность: Осторожно обращайтесь со всеми растворами, содержащими радиоактивность. Работайте только в специально отведенных вытяжках или скамейках. Все материалы (наконечники, трубки, пластины и т. д.) или промывочные буферы, контактирующие с радиоактивными веществами, должны собираться и утилизироваться отдельно. Проделайте то же самое для всех шагов ниже (шаги 1.5-1.18).
5. Добавьте VHH-2xTS в 1x PBS в среду для сульфатного мечения до конечной концентрации 2 мкг/мл.
   заметка: В качестве контроля также включите VHH-std или другое нанотело, лишенное сайтов TS, для демонстрации специфической маркировки.
6. Замените SFM 0,7 мл сульфатной среды для мечения, содержащей 0,5 мКи/мл [35S]сульфата и 2 мкг/мл VHH-2xTS, и инкубируйте клетки в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе с 7,5%_CO2, предназначенном для работы с радиоактивностью><. заметка: В зависимости от планируемого эксперимента время сульфатации нанотел нуждается в корректировке. Кроме того, для определения кинетики прихода TGN выполняется маркировка для разного времени (например, для 10 мин, 20 мин, 30 мин и т.д.).
7. Удалите средство для маркировки и промойте ячейки 2-3 раза ледяным 1x PBS на охлаждающей пластине или льду.
8. Добавьте 1 мл буфера для лизиса (PBS, содержащего 1% Triton X-100 и 0,5% дезоксихолата) с добавлением 2 мМ PMSF и 1x коктейля ингибиторов протеазы и инкубируйте клетки в течение 10-15 минут на качающейся платформе при 4 °C.
9. Соскребите и перенесите лизат в пробирку объемом 1,5 мл, окуните лизат в вихрь и поместите на 10-15 минут на торцевой вращатель при температуре 4 °C.
10. Приготовьте постядерный лизат центрифугированием при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
11. Используя новую пробирку объемом 1,5 мл, приготовьте 20-30 мкл суспензии из никелевых шариков в пробирке объемом 1,5 мл и промойте один раз 1x PBS, аккуратно гранулируя их при 1 000 x г в течение 1 мин.<бр/> заметка: Вместо гранул никеля можно использовать шарики стрептавидина (если нанотело биотинилировано) или гранулы белка А с IgG против эпитопа нанотела (T7- или HA-метка).
12. Перенесите постядерный лизат в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую гранулы никеля, и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C на вращателе с концом над концом для выделения нанотел. Удалите аликвоту (50-100 мкл) постъядерного лизата и вскипятите в буфере для образца SDS для последующего иммуноблот-анализа общего клеточного нанотела, репортера GFP и контроля нагрузки.
13. Промойте шарики 3 раза с помощью 1x PBS или буфера для лизиса, аккуратно гранулируя при 1 000 x g в течение 1 мин.<бр/> заметка: Для более строгой промывки бусин 20 мМ имидазол может быть включен в PBS или буфер для лизиса.
14. Осторожно удалите весь промывочный буфер из гранул, добавьте 50 μл 2x буфера для образцов и кипятите 5 минут при 95 °C.
15. Загрузите обе отваренные бусины в миди 12,5% гель SDS-PAGE и запустите в соответствии со стандартным протоколом PAGE до тех пор, пока эталонный краситель (например, бромфенольный синий) не достигнет конца разделительного геля.
    заметка: Иммуноблоттинг общего клеточного нанотела, репортер GFP и контроль нагрузки также могут быть выполнены с использованием мини-12,5% SDS-PAGE или сборного градиентного геля.
16. Зафиксируйте разделительный гель в ~30 мл фиксирующего буфера (10% уксусной кислоты и 45% метанола в ddH₂O) в течение 1 часа при RT, трижды промойте гель ~50 мл деионизированной воды и подготовьтесь к сушке геля.
17. Подсушивающие гели SDS-PAGE.​
    1. Аккуратно поместите закрепленный гель на натянутую пищевую пленку и накройте ее предварительно нарезанной фильтровальной бумагой.
    2. Поместите гель фильтровальной бумагой вниз на верхнюю часть сушильной платформы, установите вакуумную крышку и включите вакуумный насос для сушки геля. Высушите гель в течение 3-5 часов.
    3. Снимите пищевую пленку и поместите высушенный гель в авторадиографическую кассету, оснащенную люминофорным экраном.
18. Авторентгенограмма изображения с использованием Phosphor Screen Imager. Следуйте инструкциям производителя.
    заметка: В зависимости от силы сигнала, высушенные гели необходимо дольше подвергать воздействию с помощью люминофорных экранов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела против GFP	Сигма-Олдрич	1.18145Э+11	Продукт распространяется компанией SigmaAldrich, но производится компанией Roche
Модифицированная среда Орла Дульбекко (DMEM)	Сигма-Олдрич
Фетальная сыворотка теленка (ССК)	Биозапад
Сера-35 в виде сульфата натрия	Аналитика Hartmann	ARS0105	Продукт содержит 5 мКи
6-луночные планшеты	ТЭС	92406
Параформальдегид (PFA)	Апплименем	А3813
Фторомант-Г	Южная биотехнология	0100-01
Мини-протеановые гели TGX, 4-20%, 15- лунки	Био-Рад	456-1096