Анализ для количественной оценки антителоопосредованного фагоцитоза инфицированных паразитами эритроцитов

Аннотация

Источник: Quintana, M. d. P. et al., Измерение естественно приобретенных антител, индуцирующих фагоцитоз, к паразитам Plasmodium falciparum с помощью анализа на основе проточной цитометрии.J. Vis. Exp.(2020)

Это видео демонстрирует анализ фагоцитоза на основе проточной цитометрии с использованием меченых и опсонизированных эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum, моноцитами. Проточная цитометрия идентифицирует флуоресценцию в моноцитах, подтверждая успешную идентификацию опсонизированных эритроцитов посредством фагоцитоза.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Культура паразитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным правилам обращения с человеческими патогенами.

1. Поддерживайте содержание паразитов Plasmodium falciparum в соответствии со стандартным протоколом, описанным ранее в среде для культивирования паразитов (см. Таблицу материалов).
2. Поддерживайте плотную синхронизацию паразитов, используя обработку сорбитолом, как описано ранее.
3. Чтобы обеспечить экспрессию VAR2CSA на поверхности инфицированных Plasmodium falciparum эритроцитов (ИЭ), проведите повторные раунды иммуномагнитного отбора с использованием антитела против VAR2CSA (например, антитела PAM1.4, перекрестно-реактивного человеческого моноклонального VAR2CSA-специфичного IgG), связанного с белком G-магнитных шариков.
   1. Короче говоря, инкубируйте трофозоит-ИЭ на поздних стадиях с магнитными шариками, соединенными с антителом против VAR2CSA, и положительно отбирайте с помощью магнита.
   2. Разверните выбранных паразитов в культуре на несколько циклов, пока паразитемия не составит не менее 5%.
   3. В качестве альтернативы можно выбрать паразитов, которые связываются с иммобилизованным пластиком CSA (рецептором для VAR2CSA), как описано ранее.
4. Для проверки экспрессии VAR2CSA выбранных паразитов проводят проточную цитометрию, как описано ранее.
   1. Короче говоря, пометьте трофозоит-ИЭ на поздней стадии тем же антителом, которое использовалось для магнитного отбора (шаг 1.3), а затем флуоресцентно меченным вторичным антителом.
   2. Измерьте поверхностную реактивность ИЭ с помощью проточной цитометрии. Успешный отбор антител обычно приводит к тому, что популяция паразитов экспрессирует VAR2CSA у большинства паразитов (≈80%).
5. Для анализа на фагоцитоз используйте очищенные трофозоиты-ИЭ средней и поздней стадии. Выполните очистку с помощью магнитной сепарации, как описано ранее.
   заметка: Чтобы точно определить стадию появления паразитов, проводят окрашивание по шкале Гимзы по мазкам крови с последующим наблюдением под световой микроскопией. Следуйте стандартным процедурам и морфологическим рекомендациям, как описано выше. Очистка на поздней стадии также может быть выполнена с использованием среды с градиентом плотности. Выход ИЭ, однако, по нашему опыту, ниже, и, следовательно, магнитная очистка предпочтительнее.
   1. Для магнитной сепарации культуру паразита (5-10% паразитемии) вращают при 500 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл питательной среды для паразитов.
   2. Добавьте суспензию паразита в кремнезем Claricep Flash Silica, CS-колонку, соединенную с магнитом (см. Таблицу материалов), и дайте ей медленно пройти через колонку. Трофозоит-ИЭ являются парамагнитными (благодаря присутствию гемозоина) и остаются в сетке колонны.
   3. Промойте колонку 50 мл питательной среды для паразитов и вымывайте ИЭ из магнитной колонки, используя 50 мл среды для культивирования паразитов.
6. Вращайте элюат от 1.5.3 при 500 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ее в 1 мл среды для культивирования паразитов.
7. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество ИЭ (легко идентифицируемых с помощью световой микроскопии как эритроциты с пигментом темным гемозоином) и общее количество клеток для расчета итоговой паразитемии (процент ИЭ).
   заметка: Используйте только паразитов с чистотой не менее 80% (80% ИЭ).
8. Основываясь на количестве образцов сыворотки/антител, запланированных для тестирования, оцените общее количество необходимых ИЭ и соответственно увеличьте масштаб популяций паразитов. Колба для культуры размером 75 см² с 25 мл культуры с 5% гематокрита и 5-10% паразитемии должна дать достаточное количество ИЭ для работы полного 96-луночного планшета. Для полного планшета (42 образца плюс 6 контрольных образцов в двух экземплярах) требуется минимум 1,5 мл суспензии паразита в концентрации 3,3 x 10⁷ ИЭ/мл.

2. Клетки THP-1

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используется клеточная линия THP-1. Эта линия моноцитарных клеток получена от пациента с моноцитарным лейкозом и может быть приобретена в Американской коллекции типовых культур (ATCC). Поддерживайте клеточную линию в соответствии с инструкциями поставщика в культуральной среде THP-1 (см. Таблицу материалов).

1. Для регулярного поддержания начинайте культивирование клеток THP-1 при концентрации 2-4 x 10⁵ клеток/мл и субкультуру, когда концентрация клеток достигает 8 x 10⁵ клеток/мл.
   заметка: Не допускайте, чтобы концентрация клеток превышала 1 x 10⁶ клеток/мл и следите за количеством проходов. Избегайте использования ячеек, которые находятся за пределами прохода 25. Среднее время удвоения клеточной линии THP-1 колеблется в пределах 19-50 ч. Определите время удвоения партии клеток до начала экспериментов по фагоцитозу. Это поможет приблизительно оценить необходимое количество культуры, необходимое для определенного количества образцов сыворотки, подлежащих исследованию (например, для полного 96-луночного планшета требуется 10 мл культуры при концентрации 5 x 10⁵ клеток/мл).
2. Периодически проверяйте клетки THP-1 на поверхностную экспрессию Fcγ-рецепторов I (CD64), II (CD32) и III (CD16), как описано ранее.
   1. Короче говоря, окрашивание клеток THP-1 (отдельно) флуоресцентно мечеными антителами анти-CD64, анти-CD32 и анти-CD16 (Таблица материалов) в течение 30 минут при комнатной температуре (разведение 1:100, приготовленное в 2% фетальной бычьей сыворотке (FBS) в фосфатно-физиологическом буфере (PBS).
   2. Промыть три раза 2% FBS в PBS и измерить окрашивание поверхности с помощью проточной цитометрии.
      заметка: Клетки THP-1 отрицательны на CD16 и положительны на CD32 и CD64, как сообщалось ранее (Рисунок 1).
3. Для анализа фагоцитоза за день до эксперимента установите колбу с клеточной культурой THP-1 с концентрацией 2,5 x 10⁵ клеток/мл, чтобы получить около 5 x 10⁵ клеток/мл в день анализа.
   заметка: Убедитесь, что в день анализа присутствует 4-6 x 10⁵ клеток/мл.

3. Анализ на фагоцитоз (Рисунок 2)

1. Перед началом анализа заблокируйте (>1 ч) два 96-луночных планшета с круглым дном (один для опсонизации, а другой для фагоцитоза) с использованием 150 мкл стерильного 2% FBS в PBS на лунку.
   заметка: Пометьте пластину 1 как пластину для опсонизации и используйте ее как для окрашивания бромидом этидия (EtBr), так и для опсонизации. Пометьте пластину 2 как планшет для фагоцитоза и используйте как для покрытия клеток THP-1, так и для этапа фагоцитоза.
2. Окрашивание паразитами и опсонизация
   1. Возьмите суспензию ИЭ, приготовленную в 1,6, и отрегулируйте количество клеток до 3,3 x 10⁷ ИЭ/мл путем добавления питательной среды паразита и бромида этидия (EtBr) для достижения конечной концентрации 2,5 мкг/мл (разведение 1:40, из бульона 0,1 мг/мл).
      заметка: EtBr окрашивает ДНК паразита, что позволяет обнаруживать его с помощью проточной цитометрии.
      осторожность: EtBr является мутагеном и раздражителем кожи, глаз и дыхательных путей. Используйте соответствующие средства защиты и утилизируйте отходы в соответствии с местными правилами.
   2. Удалите блокирующий раствор с одной из 96 луночных пластин (пластина для опсонизации), перелистывая пластину и удаляя излишки жидкости с листа полотенцесушителя.
   3. Добавьте 30 мкл на лунку приготовленной выше суспензии IE в верхнюю половину пластины. Оставьте одну лунку пустой и добавьте 30 мкл питательной среды для паразитов (без ИЭ только для контроля THP-1). (Рисунок 3А). Выдерживать в течение 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.
   4. Добавьте 170 мкл на лунку питательной среды для паразитов. Вращайте пластину при температуре 500 x g в течение 3 минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость, перебросив пластину над подходящим контейнером для отходов.
   5. Промойте ИЭ, меченные EtBr, еще два раза, используя 200 мкл на лунку питательной среды паразитов, вращая планшет при 500 х г в течение 3 минут при комнатной температуре. Надосадочную жидкость с первой стирки можно удалить, щелкнув пластиной. Осторожно удалите надосадочную жидкость из второй промывки с помощью многоканальной пипетки, чтобы убедиться, что весь объем промывочного средства удален. Не тревожьте гранулы.
   6. Повторно суспендируйте меченые EtBr ИЭ в 30 мкл раствора антитела/плазмы/сыворотки, приготовленного в желаемых концентрациях в среде для культивирования паразитов.
   7. Всегда включайте следующие контрольные группы (рис. 3B): контроль без контроля клеток IEs/THP-1 (питательная среда паразита); контроль без антител или плазмы/сыворотки (неопсонизированный контроль); положительный контроль с использованием коммерчески доступных антител к эритроцитам кролика против человека в разведении 1:100 (см. Таблицу материалов).); два контрольных показателя в плазме/сыворотке с отрицательным результатом в соотношении 1:5 (пул без малярии и пул от мужчин, подвергшихся воздействию малярии); и положительный контроль сыворотки крови при разведении 1:5 (пул от женщин, подвергшихся воздействию малярии, которые ранее были беременны (предпочтительно мультигравидае)).
      заметка: Разведение в соотношении 1:100 для положительного контроля, по-видимому, работает последовательно для разных партий приобретенных антител (данные не показаны). Тем не менее, рекомендуется исключить различия между партиями, тестируя несколько разведений каждый раз при использовании новой партии антител.
   8. Инкубировать в течение 45 минут в темноте при температуре 37 °C.
3. Получение клеток THP-1 и фагоцитоз
   1. Пока происходит опсонанизация ИЭ (3.2.8), начните подготовку ячеек THP-1.
   2. Извлеките клетки THP-1 из колбы с культурой, открутите их (500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре), сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в среде для культивирования клеток THP-1.
   3. Снова отжмите (500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре), сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды для культивирования клеток THP-1.
   4. Определите количество клеток в приготовленном выше растворе и добавьте больше среды, чтобы получить конечную концентрацию 5 x 10⁵ клеток/мл.
   5. Удалите блокирующий раствор с оставшейся 96-луночной пластины (фагоцитозной пластины), перевернув пластину и удалив излишки жидкости с листа полотенцесушителя.
   6. Добавьте 100 мкл в каждую лунку клеточной суспензии THP-1, приготовленной в 3.3.4, и поместите ее обратно в инкубатор для клеточных культур (рис. 3C).
   7. По истечении времени инкубации антител/плазмы/сыворотки добавьте 170 мкл в лунку питательной среды для паразитов. Вращайте пластину при температуре 500 x g в течение 3 минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость, перебросив пластину над подходящим контейнером для отходов.
   8. Опсонизированные ИЭ промыть еще два раза, используя 200 мкл на лунку питательной среды для паразитов, вращая планшет при 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость с первой стирки можно удалить, щелкнув пластиной. Осторожно удалите надосадочную жидкость из второй промывки, используя многоканальную пипетку, чтобы убедиться, что весь объем промывочного средства удален. Не тревожьте гранулы.
   9. Наконец, повторно суспендируйте опсонизированные ИЭ в 100 мкл предварительно подогретой среды для культивирования клеток THP-1. Перенесите 50 мкл опсонизированной суспензии ИЭ в каждую лунку в планшете для фагоцитоза. Поскольку общее количество ИЭ составляет 100 мкл, каждое разведение антитела/сыворотки может быть выполнено в двух экземплярах в фагоцитозной пластине (рис. 3D)
      заметка: Количество IE и клеток THP-1, используемых в анализе, соответствует соотношению 10:1.
   10. Инкубировать в течение 40 минут в темноте при температуре 37 °C, 5% углекислого газа (CO₂).
       заметка: Не допускайте развития фагоцитоза более 40 минут.
   11. Остановите фагоцитоз центрифугированием при 4 °C (500 x g, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость, щелкнув планшетом. Добавьте 150 μЛ раствора лизинга хлорида аммония комнатной температуры (Таблица материалов) и перемешайте с помощью пипетирования, инкубируйте ровно 3 мин.<бр/> заметка: На этом этапе эритроциты, которые не были фагоцитированы клетками THP-1, будут лизироваться.
   12. Остановите лизис, добавив 100 мкл ледяного 2% FBS в PBS. Поверните пластину при температуре 4 °C (500 x g в течение 3 минут) и удалите надосадочную жидкость, проведя пластиной по соответствующему контейнеру для отходов.
   13. Промойте три раза, используя 200 μL на лунку ледяного 2% FBS в PBS, вращая пластину при температуре 4°C (500 x g в течение 3 минут). После окончательной промывки повторно суспендируйте в 200 мкл ледяного 2% FBS в PBS и немедленно проанализируйте с помощью проточной цитометрии.
       заметка: В предыдущих публикациях использовалась фиксация клеток в 2% параформальдегиде до проточной цитометрии³¹, но представленные здесь результаты были получены сразу после завершения анализа. Откладывать получение данных проточной цитометрии путем хранения планшета при температуре 4°C не рекомендуется, так как процент клеток EtBr⁺ THP-1 быстро распадается (рис. 4).

4. Получение и анализ проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любой проточный цитометр, поддерживающий формат 96-луночных планшетов и имеющий соответствующие лазеры/фильтры для измерения флуоресценции EtBr.

1. Для получения данных затвор на ячейках THP-1 с использованием графика линейного прямого рассеяния (FSC) в сравнении с линейным боковым рассеянием (SSC) с использованием скважин, в которые не были добавлены IE (рисунок 2A), и получение данных о 10 000 событий на этом затворе.
2. Измерьте интенсивность флуоресценции для EtBr (FL3-Log) на вентиле THP-1 с помощью гистограммы.
3. Для стробирования сначала затвор на ячейках THP-1 на графике плотности FSC в зависимости от SSC, используя лунки, в которые не были добавлены IE (рисунок 5A). Затем установите положительный вентиль на гистограмме FL3 (EtBr), используя ячейки THP-1 (без добавления IE) и неопсонизированный контроль (рисунок 5B).
4. Скопируйте эти ворота во всех других образцах, протестированных в той же пластине, и определите процент EtBr-положительных клеток THP-1 (THP-1 клеток, которые фагоцитировали хотя бы один ИЭ). Для каждого из протестированных образцов фагоцитоз может быть представлен в виде абсолютных значений (процент клеток EtBr⁺ THP-1) или в виде относительного фагоцитоза, рассчитанного в процентном соотношении с использованием положительного контроля в качестве максимума.

Результаты

Рисунок 1: Fc-рецепторы, экспрессируемые на поверхности клетки THP-1. (A) Fcγ-рецептор III/CD16 (красный). (B) Fcγ-рецептор II/CD32 (зеленый). C. Fcγ-рецептор I/CD64 (оранжевый). Непомеченные ячейки отображаются синим цветом.

Рисунок 2: Технологическая схема ан...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Планшеты для культивирования клеток на 96 лунок, круглое дно с крышкой	Корнинг	No 3799	Можно использовать любую подобную пластину, убедитесь, что она совместима с прибором проточного цитометра, который вы собираетесь использовать
АльбуМАКС-II	Gibco	11021-037 (Английский)
АльбуМАКС-II (5%)	- T	- T	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2 г/л гипоксантина (Sigma, H9377) в RPMI1640 (Sigma, R5886)
Антитела к эритроцитам	Абкам	АБ34858	Приготовьте аликвоты и заморозьте при температуре -20°C. Используйте одну аликвоту на эксперимент.
ДПБС	сигма	П8622
Dynabeads Белок G	Инвитроген	10003Д
Раствор бромида этидии	сигма	Е1510	Приготовьте стоковый раствор из расчета 0,1 мг/мл в RPMI1640 (R5886). Хранить в защищенном от света
Проточный цитометр FC500	Бекман Коултер		Можно использовать любой проточный цитометр, поддерживающий формат 96-луночных планшетов и имеющий соответствующие лазеры/фильтры для измерения флуоресценции EtBr.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	10099-141	Перед использованием нагрейте и обезвредьте.
FITC мышиный античеловеческий CD16	BD Biosciences	555406 или 556618
FITC мышиный античеловеческий CD32	BD Biosciences	552883
FITC мышиный античеловеческий CD64	BD Biosciences	555527
Программное обеспечение FlowLogic	Технологии Inivai		Можно использовать любой анализ проточной цитометрии, например FlowJo или Winlist
Гентамицин (10 мг/мл)	сигма	Г1272
Гипоксантин	сигма	Н9377
L-глютамин (200 мМ)	сигма	Г7513
Лизирующий раствор	- T	- T	15 мМ NH4Cl, 10 мМ NaHCO3, 1 мМ ЭДТА
Колонна MACS CS и аксессуары	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-041-305
Среда для культивирования паразитов	- T	- T	2 мМ L-глутамин (Sigma, G7513), 50 мкг/мл гентамицина (Sigma, G1272), 0,5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) в RPMI1640 (Sigma, R5886)
Пенициллин/стрептомицин (10000ЕД и 10 мг/мл)	сигма	П0781
RPMI-1640 средний	сигма	Р5886
Питательная среда THP-1	- T	- T	10% FBS (Gibco, 10099-141), 2 мМ L-глутамин (Sigma, G7513), 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина (Sigma, P0781) в RPMI1640 (Sigma, R5886)
Магнит Vario MACS	Милтеньи Биотек

месте