ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы описывают подготовку образцов и количественную оценку активности нейтрофильных сериновых протеаз (NSP). Представленные здесь экспериментальные методики сосредоточены на измерении активности мокроты человека и нейтрофильной эластазы (НЭ) или катепсина G (КГ). Тем не менее, небольшие изменения в протоколе пробоподготовки делают возможным анализ клеток крови и гомогенатов опухолей. Кроме того, активность матриксной металлопротеиназы и катепсина S может быть исследована аналогичным образом с помощью специальных зондов FRET
1. Подготовка образцов: выделение клеток и разделение надосадочной жидкости
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, обработку мокроты следует проводить в течение 120 минут после отхаркивания, а мокроту следует хранить на льду до дальнейшей обработки.
- Если спонтанное отхаркивание мокроты невозможно, вызывайте мокроту, как описано выше. Кратковременно вдохните 200 мкг антагониста β-2-рецепторов-антагонистов сальбутамола перед началом процедуры индукции мокроты. После этого вдохните гипертонический (6%) солевой раствор в течение 15 минут с помощью небулайзера. Соберите отхаркивающуюся мокроту в чашку Петри.
- Отделите комки слизи от слюны в чашку Петри с помощью наконечника пипетки.
- Взвесьте слизь.
заметка: Средний вес образца слизи составляет 0,8 г (варьируется от 0,1 г до 5 г); Для выполнения указанных процедур обычно достаточно 0,1 г.
- Добавьте 4 части (v/w) 10% Sputolysin (в PBS) в мокроту (например, 4 мл 10% Sputolysin на каждый грамм мокроты).
осторожность: Спусколизин состоит из концентрированного дитиотреитола в фосфатном буфере, поэтому обращайтесь с ним осторожно.
- Инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) на качающемся шейкере в течение 15 минут, чтобы слизь растворилась. В целях безопасности поместите шейкер в вытяжной шкаф.
- Угасите реакцию, добавив такой же объем холодного PBS (например: 1 мл холодного PBS на каждый мл 10% Sputolyzin).
- Перемешайте с помощью пипетирования до получения однородного раствора.
- Отфильтруйте смесь через нейлоновое сетчатое фильтр 100 мкм в пробирку объемом 50 мл.
- Повторите этап фильтрации через нейлоновое сетчатое фильтр размером 40 μм.
- Центрифугируйте раствор в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C.
- Осторожно переложите надосадочную фракцию в свежую пробирку и храните на льду.
заметка: Фракции надосадочной жидкости могут храниться при температуре -20 °C или -80 °C до дальнейшего анализа.
- Аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл холодной PBS и положите ее на лед.
заметка: Клеточную фракцию необходимо немедленно обработать.
2. Измерение активности нейтрофильной сериновой протеазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлены различные методы для количественной оценки активности NSP с помощью репортеров FRET. Выбор технологии продиктован конкретным медико-биологическим вопросом и целью эксперимента. Представленные зонды были тщательно протестированы на их специфичность по отношению к набору ферментов, относящихся к легким. Несмотря на то, что зонды специфичны по отношению к ферменту-мишени, всегда проверяйте специфичность зонда на интересующем их клиническом образце. Это может быть достигнуто путем инкубации образца со специфическим ингибитором протеазы перед добавлением зонда, что должно устранить любое увеличение соотношения донор/акцептор (D/A).
- Количественное определение активности растворимого NSP с помощью флуориметра или планшетного ридера
заметка: Активность протеазы в растворимых фракциях образца может быть обнаружена с помощью любого прибора, способного детектировать флуоресценцию.
- Разморозьте ферменты на льду.
- Перед использованием храните NE и CG в кислотном буфере для хранения (50 мМ ацетата натрия, 200 мМ NaCl, pH 5,5) для предотвращения саморасщепления.
- Чтобы построить стандартную кривую фермента, приготовьте последовательное разведение фермента в соотношении 1:2 (33,9 - 0,271 нМ для NE; 42,6 - 0,333 нМ для CG) в активационном буфере (10 мМ Tris-HCl, 500 мМ NaCl при pH 7,5). Активационный буфер имеет нейтральный pH и, следовательно, обеспечивает эффективный ферментативный катализ.
- Чтобы получить наивысшую стандартную концентрацию (концентрация NE: 33,9 нМ), разведите 1 мкл NE (33,9 μM) в 999 μл активационного буфера.
- Для приготовления второго стандарта (концентрация NE: 16,95 нМ) смешайте 200 мкл первого разведения с 200 мкл активационного буфера.
- Приступайте к приготовлению оставшихся разведений в соотношении 1:2.
- Последний стандарт, которым является бланк, состоит из чистого буфера активации. Рекомендуется измерять технические дубликаты или тройные величины. Во время стандартной и выборочной подготовки старайтесь держать флаконы на льду.
- Параллельно со стандартным препаратом разжижают образцы мокроты в активационном буфере. Перед оценкой активности протеазы образцы человека разбавляют так, чтобы они оставались в линейном диапазоне увеличения репортерного сигнала (отношение D/A). Если бы образцы пациента остались неразбавленными, расщепление произошло бы слишком быстро для надежной подгонки. Поскольку здоровая донорская мокрота содержит меньше активных протеаз по сравнению с образцами, взятыми у пациентов с муковисцидозом (МВ) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), обычно проводятся различные разведения (1:10 для здоровой надосадочной жидкости, 1:20-500 для надосадочной жидкости мокроты у пациентов с ХОБЛ или КФ).
заметка: Чтобы количественно измерить активность протеазы в образцах, концентрация которых неизвестна, необходимо измерить стандартную кривую с известными концентрациями ферментов параллельно, в идеале на одной и той же пластине. Концентрация активного фермента в мокроте человека рассчитывается путем интерполяции наклонов, измеренных в образцах мокроты человека, с наклонами, измеренными с помощью стандартных кривых.
- Перед подготовкой образцов к измерению настройте прибор. Установите длину волны возбуждения для зонда на основе резонансного переноса энергии (FRET) NE Förster (NEmo-1) равным 354 нм, а длину волны детектирования — 400 нм для донора и 490 нм для акцептора. Установите длину волны возбуждения для зонда CG FRET (sSAM) на 405 нм, а излучение установите на 485 (донор) и 580 нм (акцептор).
- Добавьте 40 мкл образцов, стандартных или холостых, в лунки черного планшета с 96 лунками половинной площади.
- Для приготовления мастер-смеси, содержащей репортеры (концентрация репортера в мастер-смеси: 10 мкМ), разбавьте зонд (1 мМ в диметилсульфоксиде, ДМСО) 1:100 в активационном буфере. Приготовьте необходимый объем основной смеси, умножив на 10 мкл на количество необходимых лунок для пластин. Для достижения оптимальной конечной концентрации (2 мкМ) для флуоресцентного измерения репортеров NEmo-1 и sSAM добавьте 10 мкл исходной смеси в каждую лунку (содержащую 40 мкл образца, стандартного или пустого) и начните считывание. Таким образом, репортеры NEmo-1 и sSAM будут контролировать активность растворимой нейтрофильной эластазы и катепсина G соответственно.
заметка: Если инжектор реагента недоступен, обязательно начните считывание как можно скорее после добавления репортера к образцам.
- Начните измерение с помощью считывателя пластин и записывайте увеличение отношения ЦАП каждые 60–90 секунд в течение не менее 20 минут или до тех пор, пока увеличение сигнала не достигнет плато.
- После экспорта данных рассчитайте отношение D/A, разделив единицы относительной флуоресценции донора (RFU) с акцепторным RFU для каждой временной точки и образца.
- Рассчитайте среднее значение отношения D/A и стандартное отклонение для каждой пробы.
- Определите наклон в пределах линейного роста изменения отношения D/A. Наклон является индикатором скорости расщепления фермента для FRET зонда. Рассчитайте концентрацию активного фермента в мокроте путем сопоставления наклонов линейной регрессии, полученных на основе образцов с человеком, с наклонами, рассчитанными на основе стандарта фермента.
