$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка микрофлюидных устройств.
- Препарат для микрофлюидного анализа миграции клеток
- Приготовьте 50 мкг/мл раствора фибронектина, разбавив 50 мкл исходного раствора фибронектина (1 мг/мл) до 950 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) в биобезопасном шкафу.
- Приготовьте среду для миграции, смешав 9 мл среды Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI-1640) и 1 мл RPMI-1640 с 4% бычьим сывороточным альбумином (BSA).
- Удалите деионизированную воду из устройства.
- Добавьте в прибор 100 μл раствора фибронектина из розетки. Подождите 3 минуты, чтобы убедиться, что все каналы заполнены раствором фибронектина. Поместите микрофлюидное устройство в закрытую чашку Петри на 1 час при комнатной температуре.
- Удалите раствор фибронектина из прибора. Добавьте 100 мкл миграционной среды из выходного отверстия. Подождите 3 минуты, чтобы убедиться, что все каналы заполнены средой для миграции.
- Инкубируйте устройство еще на 1 ч при комнатной температуре, после чего устройство будет готово к эксперименту с хемотаксисом.
- Приготовление раствора хемоаттрактанта для эксперимента по хемотаксису.
- Приготовьте 100 нМ раствор fMLP в общей сложности 1 мл миграционной среды. Смешайте 5 мкл стокового FITC-Dextan (10 кДа, 1 мМ) с раствором fMLP в пробирке объемом 1,5 мл.
заметка: FITC-Dextran используется для измерения градиента. В качестве альтернативы можно использовать Родамин в качестве индикатора градиента. После этого раствор хемоаттрактанта fMLP готов к эксперименту по хемотаксису.
- Подготовка образца мокроты.
заметка: Химиотаксис нейтрофилов, индуцированный градиентом образцов мокроты пациентов с ХОБЛ, был протестирован в качестве клинического диагностического применения этого метода «все на чипе».
- Получите протокол соблюдения этических норм для человека для сбора образцов мокроты у пациентов с ХОБЛ.
заметка: Мы получили разрешение на сбор образцов в больнице общего профиля Seven Oaks в Виннипеге (одобрено Университетом Манитобы).
- Получите формы информированного письменного согласия от всех субъектов.
- Соберите образцы спонтанной мокроты у пациентов с ХОБЛ. Поместите образец мокроты объемом 500 мкл в пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 500 мкл 0,1% дитиотреитола в пробирку объемом 1,5 мл и аккуратно перемешайте. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут.
- Центрифугируйте образец при давлении 753 x g в течение 10 минут, а затем соберите надосадочную жидкость. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 865 x g в течение 5 минут, а затем соберите окончательную надосадочную жидкость. Перед использованием храните собранную надосадочную жидкость в морозильной камере при температуре -80 °C.
- Когда все будет готово к эксперименту с хемотаксисом, разморозьте раствор мокроты; переложите 900 л миграционной среды в пробирку объемом 1,5 мл и смешайте со 100 мл раствора мокроты в биобезопасном шкафу; после чего раствор мокроты будет готов к эксперименту с хемотаксисом.
- Забор образцов крови.
- Получите протокол человеческой этики для сбора образцов крови от здоровых доноров. Получите формы информированного письменного согласия от всех доноров крови.
заметка: Здесь образцы были получены в больнице общего профиля Виктории в Виннипеге (одобрено Советом по этике совместных исследований факультета в Университете Манитобы).
- Соберите образец крови с помощью венепункции и поместите образец в пробирку с покрытием ЭДТА. Перед экспериментом храните пробирку в шкафу с биологической безопасностью.
2. Операция по анализу хемотаксиса на кристалле
- Изоляция на чипе (рис. 1B).
- Поместите 10 мкл цельной крови в пробирку объемом 1,5 мл в биобезопасном шкафу.
заметка: Подробная информация о сборе образцов крови приведена в разделе 1.4.
- Добавьте 2 мкл коктейля антител (Ab) и 2 мкл магнитных частиц (MP) из набора для выделения нейтрофилов (см. таблицу материалов) в пробирку объемом 1,5 мл и аккуратно перемешайте; это пометит клетки в крови, за исключением нейтрофилов.
- Инкубировать смесь кровь-АТ-МП в течение 5 минут при комнатной температуре.<бр/>
заметка: Это приведет к магнитной метке меченых антителами клеток в крови.
- Прикрепите два небольших магнитных диска к двум сторонам порта загрузки ячеек устройства. Отсасывайте среду из всех портов устройства.
- Медленно пипетируйте 2 мкл смеси крови и Ab-MP в микрофлюидное устройство через порт загрузки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитно помеченные клетки прикрепляются к боковым стенкам порта загрузки клеток, в то время как нейтрофилы поступают внутрь устройства и попадают в ловушку в структуре стыковки клеток.
- Подождите несколько минут, пока достаточное количество нейтрофилов не попадет в зону стыковки клеток.
3. Анализ хемотаксиса (Рисунок 1C).
- Поместите микрофлюидное устройство на предметный столик микроскопа с регулируемой температурой при температуре 37 °C.
- Добавьте 100 μл раствора хемоаттрактанта (fMLP или раствор мокроты) и 100 μл миграционной среды в предназначенные для этого входные резервуары с помощью двух пипетторов; это создаст градиент хемоаттрактанта в градиентном канале путем непрерывного ламинарного перемешивания химических веществ на основе ламинарного потока с помощью уравновешивающей под давлением структуры.
заметка: Подробная информация о заборе мокроты у пациентов с ХОБЛ приведена в разделе 1.3.
- Для эксперимента с контрольной средой добавляйте миграционную среду только в оба входных резервуара.
- Получение флуоресцентного изображения FITC-декстрана в градиентном канале.
- Импортируйте изображение в программу ImageJ с помощью команды "File|Открыть».
- Измерьте профиль интенсивности флуоресценции по градиентному каналу с помощью команды "Analyze|Профиль участка».
- Экспортируйте данные измерений в электронную таблицу для дальнейшего построения графиков.
- Инкубируйте устройство на предметном столике микроскопа с регулируемой температурой или в обычном инкубаторе для клеточных культур в течение 15 минут.
- Визуализируйте градиентный канал с помощью объектива 10X, чтобы записать конечное положение ячеек для анализа данных.
- При необходимости запишите миграцию клеток в устройстве с помощью покадровой микроскопии.
4. Анализ данных о миграции клеток (Рисунок 1C)
- Проанализируйте анализ хемотаксиса, рассчитав расстояние миграции клеток от докинговой структуры, как описано ниже. Смотрите рисунок 1C.
- Импортируйте изображение в программное обеспечение NIH ImageJ (версия 1.45).
- Выделите центр каждой ячейки, которая переместилась в градиентный канал.
- Измерьте координаты выбранных ячеек для их конечного положения. Измерьте координату точки на краю стыковочной конструкции в качестве начального положения привязки.
- Экспортируйте данные измеренных координат в программное обеспечение для работы с электронными таблицами (например, Excel). Рассчитайте расстояние миграции ячеек как разницу между конечным положением ячейки и начальным опорным положением вдоль направления градиента.
- Откалибруйте расстояние с точностью до микрометра. Рассчитайте среднее значение и отклонение расстояния миграции всех клеток как меру хемотаксиса.
- Сравните расстояние миграции в присутствии градиента хемоаттрактанта с контрольной средой эксперимента с использованием t-критерия Стьюдента.
- Если будут записаны покадровые изображения миграции клеток, миграция клеток и хемотаксис могут быть дополнительно проанализированы с помощью анализа отслеживания клеток.
заметка: Материалы, необходимые для создания и проведения хемотаксис-анализа «все на кристалле», подробно описаны в таблице материалов.
