Анализ in vitro для изучения цитотоксичности предварительно активированных CD8+ Т-клеток в отношении раковых клеток

Аннотация

Источник: Kitamura, T., et al. Обнаружение в реальном времени апоптоза опухолевых клеток in vitro, индуцированного CD8⁺ Т-клетками, для изучения иммуносупрессивных функций инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует анализ апоптоза в раковых клетках, индуцированных предварительно активированными эффекторными Т-клетками. Путем совместного культивирования этих клеток с раковыми клетками, помеченными флуоресцентными ядрами, добавляется флюорогенный субстрат, расщепляемый каспазами. Апоптотические раковые клетки будут отображать другой цвет в своих ядрах, что приведет к двойной флуоресценции. Эта двойная флуоресценция указывает на то, что раковые клетки подвергаются апоптозу.

Протокол

1. Подготовка клеток-мишеней, экспрессирующих красный флуоресцентный белок в своих ядрах

1. Получите целевую линию раковых клеток мыши из подходящего источника.
   заметка: В этом протоколе используется высокометастатическое производное опухолевых клеток молочной железы мышей E0771 (E0771-LG). Родительские клетки E0771 происходят от мышей C57BL/6.
2. Разморозьте и поддерживайте флакон с клетками E0771-LG с модифицированной средой Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM), включая 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) в инкубаторе для клеточных культур при 37 °C, 95% влажности и 5% CO₂,
   заметка: Следует подтвердить, что клетки отрицательны на микоплазму. С этой целью культивируют клетки E0771 (или исследуемые клетки) в течение 2-3 дней, как описано выше (при отсутствии антибиотиков и антимикотиков), и собирают 500 мкл питательной среды. Центрифугируйте среду при давлении 12 419 x g в течение 60 с, чтобы удалить клеточный мусор и перенести надосадочную жидкость в новые пробирки. Определите контаминацию микоплазмы с помощью имеющегося в продаже набора для тестирования на микоплазму (см. Таблицу материалов) и/или ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
3. Высейте 5 x 10 3 клеток E0771-LG в лунку в 12-луночный планшет и культивируйте клетки с 10% (v/v) FBS-DMEM в течение ночи в инкубаторе при 37 °C, влажности 95% и 5% CO₂,
   заметка: Если скорость пролиферации клеток-мишеней мала (время удвоения популяции более 36 ч), количество клеток может быть увеличено до 1 x 10⁴.
4. Замените среду 1 мл 10% (v/v) FBS-DMEM, включая полибрен 10 мкг/мл, и добавьте 25 мкл лентивирусных частиц (1 x 10⁶ TU/мл), кодирующих красный флуоресцентный белок с ограниченным ядерным ограничением (mKate2, см. Таблицу материалов).
5. Культивируйте клетки в течение 24 ч в инкубаторе при 37 °C, влажности 95% и 5%_CO2.
6. Замените среду на 10% (v/v) FBS-DMEM и культивируйте клетки в течение 24-48 ч в инкубаторе при 37 °C, влажности 95% и 5%_CO2.
7. Замените среду на 10% (v/v) FBS-DMEM, включая 1 мкг/мл пуромицина, когда клетки начнут экспрессировать красный флуоресцентный белок, и культивируйте клетки до тех пор, пока они не станут 80-90% сливающим><ися. заметка: Концентрация пуромицина будет различаться в зависимости от типа клеток-мишеней и должна быть оптимизирована с использованием нетрансфицированных клеток.
8. Субкультивировать выжившие клетки в течение 1-3 пассажей с 10% (v/v) FBS-DMEM, включая 1 мкг/мл пуромицина, и криоконсервировать запасы в системе хранения в паровой фазе жидкого азота до использования.

2. Выделение клеток-супрессоров из опухолей у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе супрессорные клетки (т.е. макрофаги, ассоциированные с метастазированием (MAM) и моноцитарно-миелоидные супрессорные клетки (M-MDSC)) выделены из легких, содержащих метастатические опухоли, установленные клетками E0771-LG. Условия для диссоциации тканей и сортировки клеток должны быть оптимизированы для выделения клеток из различных тканей.

1. Введите 1 x 10⁶ раковых клеток (E0771-LG) в хвостовую вену сингенных (C57BL/6), самок, 7-10-недельных мышей.
2. Через 14 дней изолируют легкое, содержащее метастатические опухоли, и готовят суспензии одиночных клеток из перфузированных легких путем ферментативного пищеварения, как описано ранее.
   заметка: В этом протоколе четырем мышам вводят раковые клетки, и их метастатические легкие объединяются для получения достаточного количества клеток-супрессоров.
3. Суспензии одиночных клеток инкубируют с антителами к мышиному CD16/CD32 в течение 30 мин на льду и окрашивают флуоресцентными антителами к CD45, F4/80, CD11b, Ly6C и Ly6G (см. Таблицу материалов) в течение еще 30 мин.
4. Один раз промойте окрашенные клетки 1 мл PBS, содержащего 2% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA), и повторно суспендируйте клеточную гранулу 500–1000 μL PBS, содержащей 2% (w/v) BSA.
5. Добавьте 3 мкМ DAPI и отсортируйте M-MDSC (^DAPI–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^{с высокимуровнем} Ly6C) и MAM (^DAPI–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^{с высоким}уровнем Ly6C^низким) с помощью сортировщика клеток (рис. 1).
   заметка: Порог уровня Ly6C для различения MAM (Ly6Clow) и M-MDSCs (Ly6Chigh) основан на пороге резидентных альвеолярных макрофагов (RMAC). Чистота отсортированных клеток измеряется с помощью проточной цитометрии с ожидаемой чистотой более 90%.
6. Ресуспендируйте отсортированные клетки 400 μL DMEM, содержащим 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин, 2 мМ L-глутамина, 1% (v/v) заменимой аминокислоты, 1 мМ пирувата натрия и 50 нМ 2-меркаптоэтанола (называемого обогащенным DMEM, E-DMEM).
7. Подсчитайте количество живых клеток с помощью метода исключения трипанового синего и отрегулируйте до 2 x 10⁶ клеток/мл с помощью E-DMEM.
8. Держите клетки на льду до использования.

3. Выделение CD8⁺ Т-клеток из селезенки мышей

1. Выделите селезенку у мыши, которая является сингенной по отношению к целевой линии раковых клеток (т.е. мышей C57BL/6 в этом протоколе) следующим образом:
   1. Усыпьте животное путем ингаляции_CO2
   .
   2. Поместите животное на чистую доску для вскрытия и протрите кожу 70% (v/v) этанолом.
   3. Разрежьте кожу живота с помощью ножниц, чтобы обнажить селезенку
   4. Изолируйте селезенку, которая расположена ниже желудка, и поместите ее в пробирку, содержащую 5 мл ледяного PBS.
2. С помощью внутреннего поршня стерильного шприца объемом 5 мл измельчите селезенку на клеточном ситечке 100 мкм, установленном на трубке объемом 50 мл.
3. Пропустите клетки через фильтр, используя в общей сложности 10 мл PBS.
4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 337 x g в течение 5 мин и отсасывайте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл PBS, содержащей 2 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и 0,5% (масс./об.) BSA (бегущий буфер) и отфильтруйте через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм.
6. Подсчитайте количество активных клеток и отрегулируйте до 1 x 10⁸ клеток/мл с помощью бегущего буфера.
   заметка: Сохраните небольшую аликвоту клеток в качестве образца перед обогащением для проверки чистоты.
7. Обогащение для CD8⁺ Т-клеток с помощью набора для отбора негативов и магнитного сортировщика (см. Таблицу материалов).
   1. Перенесите 1 x 10⁸ (1 мл) клеток спленоцитов в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
   2. Добавьте 50 μл биотинилированных антител и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
   3. Добавьте 125 μл стрептавидин-конъюгированных магнитных шариков и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
   4. Добавьте 1,325 мл проточного буфера и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.
   5. Поместите трубку в магнит и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2,5 минут.
   6. Возьмите в руки магнит, и вылейте обогащенную клеточную суспензию в новую пробирку.
8. Ресуспендируйте обогащенные клетки 200 мкл E-DMEM (т.е. DMEM, содержащий 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин, 2 мМ L-глутамина, 1% (v/v) заменимой аминокислоты, 1 мМ пирувата натрия и 50 нМ 2-меркаптоэтанола).
9. Подсчитайте количество живых клеток и отрегулируйте до 2 x 10⁶ клеток/мл с помощью E-DMEM. Выдерживайте ячейки при температуре 37 °C в инкубаторе с_CO2 до использования.
   заметка: Сохраните небольшую аликвоту клеток в качестве образца после обогащения для проверки чистоты.
10. Определить чистоту CD8⁺ Т-клеток методом проточной цитометрии можно следующим образом:
    1. Возьмите 1 x 10⁴ ячейки из образцов до обогащения (шаг 3.6) или после обогащения (шаг 3.9) и отрегулируйте общий объем каждой до 100 мкл с помощью работающего буфера.
    2. Суспензии одиночных клеток инкубировать с антителами к мышиному CD16/CD32 в течение 30 мин на льду и окрашивать флуоресцентными антителами к CD45, CD3, CD4 и CD8 (см. Таблицу материалов) в течение еще 30 мин.
    3. Промойте окрашенные клетки 500 мкл PBS, содержащим 2% (w/v) BSA, и повторно суспендируйте клеточную гранулу 500–1000 μL PBS, содержащей 2% (w/v) BSA.
11. Добавьте 3 мкМ 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и определите процентное содержание CD3⁺CD4^–CD8⁺ клеток в общей популяции CD45⁺ клеток.

4. Активация и экспансия выделенных CD8⁺ Т-клеток

1. Аликвота 1 x 10⁵ клеток на 50 мкл CD8⁺ Т-клеток (приготовленных на стадии 3.9) в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном.
2. Добавьте в лунки 1 x 10⁵ клеток на 50 мкл супрессорных ячеек (приготовленных на шаге 2.7) или 50 мкл E-DMEM.
3. Приготовьте активационную среду, состоящую из E-DMEM, 4 x 10⁴ Ед/мл колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1), 240 Ед/мл интерлейкина-2 (IL-2), 8 мкг/мл антитела против мышиного CD3ε и 16 мкг/мл антитела против мыши><ного CD28. заметка: CSF-1 не требуется для активации Т-клеток, но необходим для выживания клеток-супрессоров в этом протоколе (т.е. MAM и M-MDSC). Таким образом, он сохраняется в кокультуре Т-клеток с раковыми клетками-мишенями для поддержания консистенции в условиях культивирования. Поскольку CSF-1 обнаруживается в наномолярных концентрациях во всех тканях и необходим для жизнеспособности моноцитов/макрофагов in vivo, это физиологический контекст для этих клеток.
4. Добавьте 50 мкл активационной среды (стадия 4.3) и 50 мкл E-DMEM с исследуемыми реагентами или без них.
5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, влажности 95% и 5%_CO2 и культивируйте клетки в течение 4 дней.

5. Настройка ко-культивирования клеток-мишеней с предварительно активированными CD8⁺ Т-клетками

1. Добавьте 30 мкл разбавленной растворимой матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста 1:100 (Таблица материалов) в лунки 96-луночного планшета с плоским дном, пригодные для микроскопии, и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с_CO2 в течение не менее 1 ч.
2. Подготовьте клетки-мишени (т.е. клетки E0771-LG, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, ограниченный ядерными свойствами).
   1. Инкубируйте клетки-мишени с 1 мл 0,05% трипсина/ЭДТА при комнатной температуре в течение 1 минуты и соберите клетки с помощью осторожного пипетирования.
   2. Добавьте 9 мл DMEM, включая 10% (v/v) FBS, и центрифугируйте клеточную суспензию при 337 x g в течение 5 минут.
   3. Повторно суспендируйте клетки с 500 мкл E-DMEM и подсчитайте количество живых клеток.
      заметка: Прежде чем подсчитывать целевые клетки, отфильтруйте клетки через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, чтобы получить суспензию для одиночных клеток.
   4. Отрегулируйте плотность до 2 x 10⁴ клеток/мл (= 1 x 10³ ячейки на 50 μл), добавив E-DMEM, и держите клетки на льду.
3. Подготовьте эффекторные клетки (т.е. предварительно активированные CD8⁺ Т-клетки).
   1. Тщательно ресуспендируйте клетки в лунке 96-луночного планшета (шаг 4.5) с помощью пипетирования и перенесите плавающие CD8⁺ Т-клетки в новую пробирку объемом 1,5 мл.
      заметка: MAM и M-MDSC плотно прилегают к лунке и не отсоединяются при пипетировании.
   2. Чтобы собрать оставшиеся клетки, добавьте 200 мкл PBS в лунку и перенесите его в трубку на шаге 5.3.1.
   3. Промойте клетки 1 мл E-DMEM один раз (центрифуга при 337 x g) в течение 5 минут, аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость) и повторно суспендируйте их 100 μл E-DMEM.
   4. Подсчитайте количество живых клеток (используя метод исключения трипанового синего), отрегулируйте плотность до 1,6 x 105 клеток/мл (= 4 x 10³ клеток/25 μл) и держите клетки на льду.
4. Аспирируйте матрицу базальной мембраны из каждой лунки пластины на шаге 5.1.
5. Добавьте 1 x 10³ ячейки/50 мкл целевых клеток (шаг 5.2.4) в каждую лунку и хорошо перемешайте.
   заметка: Чтобы избежать краевых эффектов из-за испарения среды, для анализа следует использовать только внутренние 60 лунок 96-луночной пластины.
6. Добавьте 25 μL E-DMEM, включая 4 x 10,³ U/mL IL-2 и 10 μM субстрат флуорогенной каспазы-3 (см. Таблицу материалов).
7. Добавьте 4 x 10³ клетки/25 μL CD8⁺ Т-клеток (шаг 5.3.4) в соответствующие лунки и хорошо перемешайте.
   заметка: Наличие слишком большого количества клеток в лунке затрудняет анализ. В этой модели соотношение эффектор: цель 4:1 (общее количество ячеек 5 x 10³ ячейки/лунка) было оптимальным, но соотношение 8:1 было неоптимальным. Лунки, содержащие следующие четыре элемента управления, необходимы для помощи в анализе данных: клетки-мишени с плотностью, используемой для лунок для совместного культивирования (1 x 10³ клетки/лунка) в среде с субстратом каспазы-3 и без него, эффекторные клетки (1 x 10³ клетки/лунка) в среде с субстратом каспазы-3 и без него.
8. Добавьте 200 мкл PBS или стерильной воды во все пустые лунки (особенно лунки на периферии пластины), чтобы уменьшить испарение среды из экспериментальных лунок.
9. Поместите планшет в покадровый флуоресцентный микроскоп, который поддерживается при температуре 37 °C, влажности 95% и 5% CO₂,<бр/> заметка: Встряхните пластину крестообразно, чтобы равномерно распределить все ячейки, а затем дайте пластине постоять при комнатной температуре на ровной поверхности в течение 10-20 минут перед переносом в инкубатор.

6. Визуализация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные настройки получения изображений будут варьироваться в зависимости от используемого микроскопа и флуорофоров; для получения оптимальных результатов следует использовать следующие общие параметры съемки.

1. Используя соответствующую процедуру автофокусировки на микроскопе, получите изображения, охватывающие не менее 25% от общей площади поверхности в каждой экспериментальной лунке 96-луночного планшета.
2. Настройте микроскоп таким образом, чтобы он получал изображения в фазовом контрасте, а также флуоресцентный канал, подходящий для красного флуоресцентного белка (mKate2), ограниченного ядерным ограничением, и флуоресцентный канал, подходящий для зеленого флуорогенного активированного субстрата каспазы-3 (с возбуждением на длине волны 488 нм) (рис. 2).
3. Получение изображений в экспериментальных лунках в фазовом контрасте и по 2 флуоресцентным каналам каждые 1–3 ч в течение не менее 72 ч.

Результаты

Рисунок 1. Стратегия гейтирования для выделения клеток-супрессоров из метастатического легкого. (A) Репрезентативные точечные диаграммы для выделения моноцитарных миелоидных супрессорных клеток (M-MDSC) и макрофагов, ассоциированных с метастазированием (MAM). Порог уровня Ly6C для различения MAM (^низкий уровень Ly6C) и M-MDSC (^{высокий} уровень Ly6C) основан на по...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% трипсина ЭДТА (1X)	Gibco	No 25300-054
12-луночный планшет для культивирования клеток	Фрейнер Био-Уан	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-меркаптетанол	сигма	М6250-10МЛ
Трубка с круглым дном из плизилирола 5 мл	сокол	352054
96-луночный планшет для культивирования клеток (круглое дно)	Костар	No 3799	Совместное культивирование CD8+T-клеток с отсортированными миелоидными клетками
Планшет на 96 лунок (Плоское дно)	Нунк	165305	Совместное культивирование CD8+T-клеток с клетками-мишенями для анализа цитотоксичности
AF647 антитело к мышам F4/80	БИО-РАД	MCA497A647	Клон: CIA3-1, Лот#: 1707, 2 μL/1x10^6 ячеек
AlexaFluor700 антитело к мышиному CD8	Биолегенда	100730 (Английский	Клон: 53-6.7, Лот#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
антитела к мышиному CD28	Биолегенда	102111	Активация выделенных CD8+ Т-клеток, клон: 37.51, лот#: B256340
антимышиное антитело CD3e	Биолегенда	100314	Активация выделенных CD8+ Т-клеток, клон: 145-2C11, лот#: B233720
Антитела к мышиному CD3 APC	Биолегенда	100236	Клон: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
Антитело Ly6C к мышам APC/Cy7	Биолегенда	128026	Клон: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 элементов
Бычья сыворотка Albmin	сигма	А1470-100Г
Сетчатый фильтр (нейлон 100 мкм)	сокол	No 352360 (Английский	Чтобы разбить селезенку
Сетчатый фильтр (нейлон 40 мкм)	сокол	352340 (Английский	Для фильтрации легкого пищеварения
DAPI	Биолегенда	422801
Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ Т-клеточный набор для выделения	Технологии стволовых клеток	19853
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270-106
Антитела FITC к мышиному CD4	Биолегенда	100406	Клон: GK1.5, Лот#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
Geltrex Готовый	Gibco	А1596-01	Нанесение покрытий на 96-луночные планшеты для анализа цитотоксичности
Реагент IncuCyte NucLight Red Lentivirus	Эссен БиоНаука	No 4476	Вирусные части ленти, кодирующие mKate2
Зум IncuCyte	Эссен БиоНаука		Детектор (флуоресцентный микроскоп)
IncuCyte ZOOM 2018A	Эссен БиоНаука		Программное обеспечение для анализа
L-глютамин (100X)	Gibco	A2916801
Набор для диссоциации легких	Милтеньи	Тел.: 130-095-927	Приготовление суспензии одиночных клеток из опухолевого легкого
Набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert	Лонза	ЛТ07-318
Заменимые аминокислоты (100X)	Gibco	11140-035 (Английский)
NucView488	Биотиум	10403	Флуорегенный субстрат каспазы-3
ПЭ антитело к мышиному Ly6G	Биолегенда	127607	Клон: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
PE/Cy7 антитело к мышиному CD11b	Биолегенда	101216	Клон: M1/70, Лот#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
Стрептококк	Gibco	15140-122	Пенициллин стрептомицин для первичной культуры клеток
PerCP/Cy5.5 антитело к мышиному CD45	Биолегенда	103132	Клон: 30-F11, Лот#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 ячеек
Полибрен (гексадиметрина бромид)	сигма	Н9268
Пуромицин	Gibco	А11138-03
Буфер для лизиса эритроцитов (10X)	Биолегенда	420301
Мышиный рекомбинантный ИЛ-2	Пепротех	212-12	Активация выделенных CD8+ Т-клеток
Пируват натрия (100X)	Gibco	11360-070 (Английский)
Антитело TruStain fcX (антимышиный CD16/32)	Биолегенда	101320 Номер 101320

) ) ) г. продукт