Оценка активации множественных каспаз в макрофагах

Аннотация

Источник: Han, J. et al., Оценка активации каспазы для оценки смерти клеток врожденного иммунитета.J. Vis. Exp.(2023)

Это видео демонстрирует оценку активации множественных каспаз в макрофагах, полученных из костного мозга, посредством стимуляции вирусом гриппа. После лизиса макрофагов, тепловой инактивации лизата и центрифугирования собираются внутриклеточные каспазы для последующего иммунологического анализа.

Протокол

1. Подготовка решений

1. Подготовьте среду, кондиционированную L929.
   1. Планшет 1 × 10⁶ клеток L929 (см. Таблицу материалов) в колбу для культуры тканей размером 182^см2, содержащую 50 мл питательных сред L929 (см. Таблицу 1 для приготовления среды).
   2. Выращивайте клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5% углекислого газа,_CO2.
   3. Через 7 дней соберите надосадочную жидкость, и отфильтруйте с помощью фильтра 0,45 мкм. Приготовьте 50 мл аликвот (храните замороженные аликвоты при температуре −80 °C до 1 года).
2. Приготовьте 500 мл питательных сред, полученных из макрофагов костного мозга (МПМД) (табл. 1).
3. Приготовьте 500 мл среды для стимуляции BMDM (табл. 1).
4. Приготовьте 500 мл среды для заражения (табл. 1).
5. Приготовьте 100 мл 1 М Трис буфера (табл. 1).
6. Приготовьте 4x буфер из додецилсульфата натрия (SDS) (Таблица 1).
7. Приготовьте 1 мл 1 М 1,4-дитиотреитола (DTT, табл. 1).
8. Приготовьте 40 мл буфера для лизиса каспазы (табл. 1).
9. Приготовьте 100 мл 1,5 М Трис буфера (табл. 1).
10. Приготовьте 100 мл 10% (масс./об.) раствора SDS (Таблица 1).
11. Приготовьте 50 мл буфера для радиоиммунопреципитации (RIPA) 2x (Таблица 1).
12. Приготовьте раствор липополисахарида 5 мг/мл, ЛПС (табл. 1).
13. Приготовьте 0,5 М аденозинтрифосфата, раствор АТФ (табл. 1).
14. Приготовьте вестерн-блоттинговые растворы.
    1. Приготовьте 1 л 5-кратного буферного запаса (Таблица 1).
    2. Подготовьте 1 л 10-кратного буферного запаса (Таблица 1).
    3. Приготовьте 1 л трис-буферного физиологического раствора с Tween 20 (TBST, таблица 1).
    4. Приготовьте 100 мл 5% (масс./об.) раствора для блокировки обезжиренного молока (Таблица 1).
15. Приготовьте первичные растворы антител.
    1. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-1 (табл. 1).
    2. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-11 (табл. 1).
    3. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-3 (табл. 1).
    4. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-7 (табл. 1).
    5. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-8 (табл. 1).
    6. Приготовьте 10 мл первичного антитела к каспазе-9 (табл. 1).
    7. Приготовьте 10 мл HRP-конъюгированного β-актинового первичного антитела (табл. 1).
16. Приготовьте вторичные растворы антител.
    1. Приготовьте 10 мл вторичного антитела против кролика (табл. 1).
    2. Приготовьте 10 мл вторичного антитела против мышей (табл. 1).
    3. Приготовьте 10 мл вторичного антитела против крыс (табл. 1).

2. Выделение макрофагов, полученных из костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола могут быть использованы мыши дикого типа в возрасте 6-10 недель с интактными путями запрограммированной клеточной смерти (PCD) или мутантные мыши с удаленными или измененными регуляторами PCD, эффекторами или молекулами, представляющими интерес

.

1. Усыпьте мышь в камере CO₂ со скоростью потока, которая смещает 10%-30% объема клетки в минуту в течение 2-3 минут. Затем проведите вторичный метод эвтаназии, например, вывих шейки матки. Соблюдайте все дополнительные рекомендации и правила, действующие в учреждениях, учреждениях и государственных органах, где это применимо.
2. Препарируйте мышь, чтобы извлечь кости задних ног.
   1. Прикрепите мышь к спине так, чтобы брюшко было обнажено. Сбрызните 70% этанолом для стерилизации задних лап и брюшной полости.
      осторожность: Этанол легко воспламеняется. Держите его подальше от открытого огня.
   2. С помощью ножниц сделайте разрез по средней линии живота; продолжайте резать по направлению к ногам, чтобы сделать бедренные кости видимыми.
   3. Возьмите правую заднюю ногу и оттяните кожу от тела к средней линии. Отделите ногу от тела, разорвав приводящие мышцы по направлению к средней линии; Затем разрежьте ногу между тазобедренным суставом и позвоночником. Затем отрежьте лапу дистальнее лодыжки и удалите лишнюю ткань с кости, сняв кожу и с помощью слегка приоткрытых ножниц снимите ткань икры.
   4. Положите ногу на полотенце, пропитанное этанолом на 70% (об/об.), и рассеките большеберцовую и бедренную кости.
      1. Обхватите большеберцовую и бедренную кости каждый отдельным набором щипцов. Аккуратно прижмите большеберцовую кость к естественному направлению коленного сустава; Это приведет к тому, что большеберцовая кость сломается в колене.
      2. При необходимости используйте щипцы и ножницы для препарирования, чтобы удалить остатки свисающей ткани. Сохраните большеберцовую кость для последующего использования, положив ее на полотенце, пропитанное этанолом.
      3. Соберите бедренную кость таким же образом, отломив от колена.
   5. Повторите шаги 3 и 4 выше для левой ноги, чтобы удалить ее из тела и рассечь большеберцовую и бедренную кости.
   6. Опрыскайте кости 70% (об/об.) этанолом.
   7. Очистите кости, положив их на чистое полотенце, пропитанное этанолом на 70% (об/об.), сожмите мясистую часть полотенца и потерев полотенце о кость, чтобы удалить лишнюю ткань.
3. Как только обе бедренные кости и обе голени станут чистыми, опрыскайте все четыре кости 70% этанолом. Соберите кости в стерильную чашку Петри и промойте их 10 мл питательной среды BMDM, осторожно прополоскав среду в чашке.
4. Наполните шприц объемом 10 мл 10 мл свежей питательной среды BMDM и прикрепите иглу 25 G.
5. Поднимите большеберцовую кость с помощью щипцов, затем разрежьте голеностопный сустав под углом ~45°.
6. Промойте костный мозг из большеберцовой кости.
   1. Держите большеберцовую кость над трубкой объемом 50 мл узким концом большеберцовой кости вниз. Нанесите средство на голень из наполненного шприца.
   2. Введите иглу (сначала осторожно) в верхний конец костного мозга и выдавите фильтрующий материал.
   3. Извлеките иглу и введите снова. Используйте короткие нажатия под высоким давлением для дозирования среды и перемещения иглы в костный мозг.
   4. Как только среда начнет вытекать из нижней части кости, используйте короткие нажатия под высоким давлением, чтобы продолжить вымывание клеток. Следите за цветом кости во время этого процесса, а когда кость станет белой, выбросьте ее.
   5. Проделайте это для обеих голеней.
7. Повторите шаги 5 и 6 выше для бедренных костей, разрезая тазобедренный сустав так же, как большеберцовая кость была разрезана на голеностопном суставе. Используйте ту же пробирку объемом 50 мл для сбора питательных сред BMDM во время промывания костного мозга.
8. После того, как все четыре кости будут промыты, аспирируйте костный мозг и среду из пробирки объемом 50 мл вверх и вниз 3 раза через иглу 18 G на шприце объемом 10 мл, каждый раз промывая боковые стороны трубки, чтобы рассеять костный мозг.
9. Отрегулируйте окончательный объем пробирки объемом 50 мл до 30 мл с помощью питательных сред BMDM и убедитесь, что клетки полностью подвешены.
10. Используйте клеточный фильтр 70 мкм для фильтрации питательных сред BMDM из пробирки объемом 50 мл.
11. Полученную клеточную суспензию, содержащую клетки-предшественники костного мозга, разложить в три 150 мм чашки для культуры тканей, добавив в каждую по 10 мл (или ~20 × 10⁶ клеток). Затем добавьте еще 10 мл питательных сред BMDM в каждую чашку. Инкубировать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C.

3. Дифференциация BMDM и обшивка для экспериментов

1. Инкубируйте пластинчатые клетки-предшественники костного мозга при 37 °C в течение 3 дней. Затем выньте каждую чашку и добавьте еще 5-8 мл питательных сред BMDM (Таблица 1). Верните в инкубатор при температуре 37 °C.
2. На 5-й день после первоначального нанесения выньте каждую чашку и добавьте еще 5 мл питательной среды BMDM. Верните в инкубатор при температуре 37 °C.
3. На 6 день уберите каждую посуду и выбросьте фильтрующий материал. Затем добавьте 10 мл холодного (хранящегося при температуре 4 °C) фосфатно-солевого буфера (PBS) для мытья один раз. Выбросьте 10 мл холодной ванны PBS. Затем добавьте 10 мл свежего холодного PBS в каждое блюдо и выдержите каждое блюдо на льду в течение 5 минут.
4. С помощью скребка для клеток аккуратно соскребите клетки со всех трех чашек в одну пробирку объемом 50 мл. Аккуратно отжимайте ячейки при 270 × г при 4 °C в течение 5 минут; Затем выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте 20 мл питательных сред BMDM, пипеткой вверх и вниз для ресуспендирования гранулы и подсчитайте количество клеток.
   заметка: Ожидается, что каждая мышь даст примерно 60 × 10 6-100 × 10⁶ клеток.
6. Спланируйте схему расположения 12-луночных планшетов для желаемого анализа in vitro на гибель/стимуляцию воспаления клеток. Планируйте пластину 1 × 10^{по 6} клеток в лунку. Для каждой запланированной интенсификации включают, по меньшей мере, три биологических репликации и помещают один набор лунок в буфер для лизиса каспазы, а второй набор лунок — в буфер для RIPA.
7. Планшет 1 × 10⁶ клеток в 1 мл питательных сред BMDM на лунку в 12-луночных планшетах. Культивирование в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C перед тем, как приступить к оценке гибели клеток/воспаления. После ночной инкубации удалите среду и добавьте 1 мл теплой (37 °C) PBS в каждую лунку для промывания клеток.
8. Удалите промоушку PBS и добавьте 500 μл среды для стимуляции BMDM с антибиотиками (при проведении небактериальной стимуляции) или среды для стимуляции BMDM без антибиотиков (при проведении бактериальной стимуляции) (Таблица 1). Инкубируйте в течение 2 ч, прежде чем перейти к этапу 4 для стимуляции/инфекции in vitro.

4. Стимуляция или заражение клеток

ВНИМАНИЕ: Агенты, включенные в этот протокол, являются потенциально патогенными и должны обрабатываться с соответствующими мерами предосторожности на объекте уровня биобезопасности 2 (BSL2) с одобрения соответствующих институциональных и правительственных органов.

1. Стимулируйте МПДМ для активации клеточной смерти с помощью интересующего их триггера.
   заметка: Для целей настоящего протокола в качестве иллюстрации используются вирус гриппа А (IAV), вирус простого герпеса 1 (HSV1), Francisella novicida и LPS + ATP, но могут использоваться и другие триггеры.
   1. Пример стимуляции 1: Инфицирование с помощью IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (сконструировано по Hoffmann et al.; титр вируса для определения множественности инфекции [MOI] рассчитывается с помощью анализа бляшек в клетках MDCK):
      1. Рассчитайте объем вируса, необходимый для заражения при кратности инфекции (MOI) в 20 бляшечных единиц (PFU), используя уравнение (1) и уравнение (2):
         
         
         
   2. Удалите среду из BMDM и промойте элементы 500 μL PBS. Добавьте 450 мкл IAV (20 MOI) в DMEM с высоким содержанием глюкозы без инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки, (HI)-FBS в каждую лунку. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 1 ч во влажном инкубаторе, чтобы обеспечить впитывание.
   3. Снимите пластины и добавьте 50 μL HI-FBS. Верните планшеты в инкубатор при температуре 37 °C. Инкубируйте в общей сложности 12 часов.

5. Сбор комбинированной надосадочной жидкости и лизата белка для использования при вестерн-блоттинге каспазы

1. Через 4 ч, 12 ч или 16 ч инкубации (конкретное время зависит от используемого триггера) извлеките планшет из инкубатора.
2. Удалите 150 мкл надосадочной жидкости; выбросьте или сохраните ее для других анализов надосадочной жидкости (например, иммуноферментного анализа [ИФА]). Не удаляйте остатки надосадочной жидкости.
3. Создайте раствор для сбора белка путем объединения 50 мкл буфера для лизиса каспазы + 100 мкл 4-кратного буфера SDS на лунку (табл. 1). Затем добавьте по 150 мкл смеси в каждую лунку.
4. Для каждой лунки пипеткой подавайте смесь вверх и вниз, чтобы собрать лизированные клетки и надосадочную жидкость. Во время пипетирования также соскребите дно лунки наконечником пипетки, чтобы нарушить работу клеток. После соскабливания и пипетирования соберите лизат белка в помеченные пробирки объемом 1,5 мл.
5. С помощью нагревательного блока нагрейте все пробирки до 100 °C в течение 12 минут.
6. Гранулируйте любые нерастворимые компоненты центрифугированием при 14 500 × г в течение 30 с при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы - белок из объединенной надосадочной жидкости и лизатов белка может быть использован либо немедленно, либо храниться при температуре −20 °C до 2 месяцев или при температуре −80 °C до 6 месяцев до готовности к использованию.

категория	Реагентов	подготовка	Замечания	Меры предосторожности
Медиа	Питательные среды L929	1) Тепло инактивирует FBS (см. примечания). 2) Смешайте 43,5 мл модифицированной среды Дульбекко (IMDM) от Iscove, 5 мл инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (HI-FBS), 0,5 мл пирувата натрия, 0,5 мл заменимых аминокислот и 0,5 мл пенициллина и стрептомицина.	Тепловой инактив FBS путем инкубации при 56 °C в течение 30 минут.
	Питательные среды макрофагов, полученных из костного мозга (МПМД)	Смешайте 290 мл IMDM, 150 мл L929-кондиционированной среды и 5 мл заменимых аминокислот, 50 мл HI-FBS и 5 мл пенициллина и стрептомицина.	Перед использованием нагрейте среду до 37 °C в водяной или ванной. Носители могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
	Среда для стимуляции BMDM антибиотиками	Смешайте 445 мл модифицированной Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, 50 мл HI-FBS и 5 мл пенициллина и стрептомицина.	Перед использованием нагрейте среду до 37 °C в водяной или ванной. Носители могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
	Среда для стимуляции BMDM без антибиотиков	Соедините 450 мл DMEM и 50 мл HI-FBS.	Перед использованием нагрейте среду до 37 °C в водяной или ванной. Носители могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
	Среда для инфекции (без HI-FBS)	Соедините 495 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы с 5 мл пенициллина и стрептомицина.	Перед использованием нагрейте среду до 37 °C в водяной или ванной. Носители могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
Буфер додецилсульфата натрия (SDS)	1 М Трис буфер<бр /> (для 4x буфера SDS)	1) Растворите 12,11 г Триса в 80 мл деионизированной воды. 2) Отрегулируйте pH до 6,8, добавив капли HCl во время перемешивания. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 100 мл.	Буфер можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.	HCl едкий. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. HCl следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
	4x буфер SDS	1) Смешайте 60 мл 1 М раствора триса (pH 6,8), 24 мг SDS, 100 мг бромофенола синего, 120 мл глицерина, 8,4 мл β-меркаптоэтанола (BME) и 90 мл деионизированной воды. 2) Перемешайте на нагревательной тарелке, чтобы соли вошли в раствор. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 300 мл.	Буфер может быть аликвотирован и храниться при температуре −20 °C до 1 года.	SDS является едким, а BME канцерогеном. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. SDS и BME следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
Буфер для лизиса каспазы	1 М 1,4-дитиотреитол (DTT)	Растворите 0,154 г порошка DTT в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Позвольте DTT войти в решение.	Буфер может быть аликвотирован в 200 мкл аликвот и храниться при температуре −20 °C до 1 года.
	Буфер для лизиса каспазы	Смешайте 35 мл деионизированной воды, 4 мл NP-40, 750 мкл 1 М ДТТ, 1 таблетку ингибитора протеазы и 1 таблетку ингибитора фосфатазы.	Буфер можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
Буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA)	1,5 М Трис буфер<бр/> (для буфера RIPA)	1) Растворите 18,2 г Триса в 80 мл деионизированной воды. 2) Отрегулируйте pH до 8,8, добавив капли NaOH во время помешивания. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 100 мл.	Буфер можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.	NaOH вызывает коррозию и может вызвать ожоги. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки.
	10% (масса/об.) раствор SDS (для буфера RIPA)	1) Добавьте 10 г SDS в 80 мл деионизированной воды. 2) Перемешайте до растворения. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 100 мл.	Раствор можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев. Если раствор выпадает в осадок, осторожно нагрейте, чтобы он снова растворился.	SDS едкий. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. С паспортами безопасности следует работать в вытяжном шкафу.
	RIPA buffer (2x стоковые)	1) Смешайте 0,5 г дезоксихолата натрия, 1 мл NP-40, 0,876 г NaCl, 3,3 мл 1,5 М Триса (pH 8,8) и 1 мл 10% (масс./об.) SDS в 46 мл деионизированной воды. 2) Перемешайте до растворения. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 50 мл.	2x запас RIPA можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.	SDS едкий. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. С паспортами безопасности следует работать в вытяжном шкафу.
Стерильные триггеры	ЛПС	Растворите лиофилизированный ЛПС из E. coli 0111:B4 в воде, не содержащей эндотоксинов, до концентрации 5 мг/мл.	Раствор может храниться при температуре −20 °C до 2 лет.
	0,5 млн АТФ	Растворите 1 г лиофилизированной АТФ в 3,63 мл воды, не содержащей эндотоксинов.	Раствор может быть аликвотирован и храниться при температуре −20 °C до 2 лет.
Западные блоттинговые решения	Запуск buffer (5x стоковый)	1) Смешайте 15 г трисового основания, 72 г глицина и 5 г SDS в 900 мл деионизированной воды><. 2) Перемешивайте до тех пор, пока не останется твердых частиц. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 1 л.	Буфер можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев.	SDS едкий. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. С паспортами безопасности следует работать в вытяжном шкафу.
	Буфер передачи (10x стоковые)	1) Соедините 30,3 г основания Tris и 72 г глицина в 900 мл деионизированной воды. 2) Перемешивайте до тех пор, пока не останется твердых частиц. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем до 1 л.	Буфер можно хранить при комнатной температуре до 3 месяцев.
	Трис-буферный физиологический раствор с Tween 20 (TBST)	1) Растворите 2,42 г основания Tris и 8,76 г NaCl в 850 мл деионизированной воды><. 2) Отрегулируйте pH до 7,4, добавляя капли HCl во время помешивания. 3) Добавьте деионизированную воду, чтобы отрегулировать конечный объем до 1 л.<бр/> 4) Добавьте 0,5 мл Tween 20 (конечная концентрация 0,05% (об./об.)).	Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца.	HCl едкий. Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты; Это будет включать в себя лабораторный халат и перчатки. HCl следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
	5% (масс./об.) раствор для блокировки обезжиренного молока	Растворите 5 г обезжиренного сухого молока в 100 мл TBST.	Раствор можно хранить при температуре 4 °C до 1 недели.
Первичные антитела	Первичное антитело к каспазе-1	Разбавьте антитело против каспазы-1 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	Первичное антитело к каспазе-11	Разбавляют антитело против каспазы-11 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	Первичное антитело к каспазе-3	Разбавьте антитело против каспазы-3 и антитело против расщепленной каспазы-3 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл каждого антитела к тем же 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	Первичное антитело к каспазе-7	Разбавьте антитело против каспазы-7 и антитело против расщепленной каспазы-7 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл каждого антитела к тем же 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	Первичное антитело к каспазе-8	Разбавьте антитело против каспазы-8 и антитело против расщепленной каспазы-8 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл каждого антитела к тем же 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	Первичное антитело к каспазе-9	Разбавляют антитело против каспазы-9 в соотношении 1:1000 (об/об.) путем добавления 10 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора, блокирующего обезжиренное молоко.	Для достижения оптимальных результатов готовьте свежие продукты для каждого эксперимента. Однако такое решение можно использовать не менее 3 раз без потери эффективности. Хранить при температуре −20 °C при повторном использовании.
	HRP-конъюгированное β-актиновое первичное антитело	Разбавьте антитело против β-актина в соотношении 1:5000 (об/об.) путем добавления 2 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора, блокирующего обезжиренное молоко.	Это антитело следует готовить свежим для каждого эксперимента.
Вторичные антитела	Антитела против кролика	Разбавьте конъюгированное пероксидазой хрена (HRP) вторичное антитело 1:5000 (об:об.) путем добавления 2 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора, блокирующего обезжиренное молоко.	Разведение антител каждый раз следует готовить в свежем виде.
	Антитела к мышам	Разбавьте конъюгированное HRP вторичное антитело 1:5000 (об:об.) путем добавления 2 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Разведение антител каждый раз следует готовить в свежем виде.
	Антитела против крыс	Разбавьте конъюгированное HRP вторичное антитело 1:5000 (об:об.) путем добавления 2 мкл антитела к 10 мл 5% (масс./об.) раствора для блокирования обезжиренного молока.	Разведение антител каждый раз следует готовить в свежем виде.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтр 0,45 мкм	Многородность	SCHVU05RE
Шприц 10 мл	BD Biosciences	309604
12-луночный планшет	Корнинг	Режим 07-200-82
Игла 18 г	BD Biosciences	305195
Игла 25 г	BD Biosciences	305122
Тюбик 50 мл	Научный центр Фишера	Тел.: 50-809-218
Сетчатый фильтр 70 μм	Корнинг	431751
Чашки для культивирования тканей 150 мм	Корнинг	430597
Колба для культуры тканей 182 см2	Дженеси Сайентиал	25-211
СПС	ИнвивоГен	TLRL-ATPL
BBL Trypticase Соевый бульон	BD Biosciences	211768
Ванна из бисера	Chemglass Медико-биологические науки	КЛС-4598-009
Биофотометр D30	Эппендорф	6133000010
Скребки для ячеек	Научные продукты CellTreat	229315
Камера CO2	ВетЭкип	901703
Кюветы	Научный центр Фишера	Тел.: 14-955-129
Ножницы для препарирования	Thermo Fisher Scientific	221С
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995-073
этанол	Фармко	111000200
Фетальная бычья сыворотка	Биозапад	С1620
фильтровальная бумага	Био-Рад	1703965
щипцы	Научный центр Фишера	22-327379 (Английский)
Francisella novicida (штамм U112)	Ресурсы BEI	НР-13
Гентамицин	Gibco	15750060
Тепловой блок	Научный центр Фишера	Тел.: 23-043-160
Вирус простого герпеса 1 (штамм HF)	АТКС	ВР-260
Высокий уровень глюкозы DMEM	сигма	Д6171
Увлажненный инкубатор	Thermo Fisher Scientific	51026282
ИМДМ	Thermo Fisher Scientific	12440-053
Вирус гриппа А (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	сконструировано по Hoffmann et al.
Элементы L929	АТКС	ВКЛ-1	Клеточная линейка для создания L929-кондиционированных сред
L-цистеин	Thermo Fisher Scientific	БП376-100
Клетки MDCK	АТКС	БКЛ-34	Клеточная линия для определения титра вируса IAV
Микроцентрифуга	Thermo Fisher Scientific	75002401
Заменимые аминокислоты	Gibco	11140050
Решение НП-40	сигма	492016
ПБС	Thermo Fisher Scientific	10010023
Пенициллин и стрептомицин	сигма	П4333
чашка Петри	Научный центр Фишера	07-202-011 (Английский
ФосСТОП	Рош	ФОСС-РО
Источник питания	Био-Рад	Телефонный номер: 164-5052
Таблетка ингибитора протеазы	сигма	С8820
Гидроксид натрия	сигма	72068
Пируват натрия	Gibco	11360-070 (Английский)
Квадратная чашка Петри	Научный центр Фишера	FB0875711A
Настольная центрифуга	Thermo Fisher Scientific	75004524
Сверхчистый липополисахарид (ЛПС) из E. coli 0111:B4	ИнвивоГен	TLRL-3PELPS
Элементы Vero	АТКС	ВКЛ-81	Клеточная линия для определения титра вируса ВПГ-1

)