Мультиплексный анализ на основе гранул для анализа цитокинов в образцах слезы человека

Аннотация

Источник: Balne, P. K., et al. Мультиплексный анализ на основе шариков для анализа профилей цитокинов слезы. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео иллюстрирует мультиплексный анализ на основе гранул для анализа цитокинов в человеческих слезах. Метод позволяет проводить одновременный анализ нескольких цитокинов из одного образца, обеспечивая повышенную чувствительность для изучения иммунных реакций при различных патофизиологических состояниях.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Анализ цитокинов слезы

1. Коллекция слез:
   1. Попросите испытуемого удобно сесть на стул для осмотра и прислонить его голову к подголовнику.
   2. Попросите испытуемого посмотреть вверх, осторожно откройте полоски Ширмера (изготовленные из фильтровальной бумаги ватмана No 41), поместите закругленный конец полоски на нижний свод глаза и попросите испытуемого закрыть глаза на 5 минут. При сборе слез будьте очень осторожны, чтобы свести к минимуму контакт с поверхностью глаза.
   3. Попросите субъекта открыть глаза, чтобы снять полоску и поместить ее в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Немедленно перенесите пробирку в лабораторию или храните ее при температуре -80 ^°C до проведения анализа на профилирование цитокинов.
2. Элюирование образца слезы из полоски слезного потока:
   1. Разрежьте полоску отрывного потока до длины 0,5 см (чтобы нормировать количество разрывов, подлежащих испытанию) и поместите ее в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   2. Добавьте 30 мкл буфера для анализа и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин с последующим центрифугированием пробирки при 14 000 x g в течение 1 мин.
   3. Переложите надосадочную жидкость в другую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и выбросьте полоску. Поместите образец, содержащий пробирку, на лед и немедленно используйте образец с элюированием слезы для профилирования цитокинов.
3. Приготовление реагентов:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сорок один аналит, который должен быть протестирован в каждом образце с помощью мультиплексного анализа на основе гранул, - это интерлейкин (ИЛ)-1α, ИЛ-1β, ИЛ-Rα, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12 p40, ИЛ-12 p70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17А, интерферон-альфа (ИФН-α) 2, ИФН-γ, ИФН-гамма-индуцируемый белок 10 (IP-10, CXCL10), хемокин макрофагального происхождения (MDC), макрофагальный воспалительный белок (MIP)-1α и MIP-1β, моноцитарный хемотаксический белок (MCP)-1, MCP-3, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), TNF-β, онкоген, регулируемый ростом (GRO), фактор роста опухоли альфа (TGF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF)-2, тромбоцитарный производный фактор роста (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эотаксин, фраталкин, растворимый CD40-лиганд (sCD40L), Fms-подобная тирозинкиназа 3 лиганд (Flt-3L) и регулируемый при активации нормальный Т-клеточный экспрессируемый и секретируемый белок (RANTES).
   1. Доведите флаконы с раствором антител (50X) до комнатной температуры (20 – 25 ^oC) и переведите флаконы в течение 1 минуты.
   2. Подсчитайте количество лунок, необходимых для проведения анализа, и рассчитайте общее количество общего раствора коктейля из гранул антител (25 мкл на лунку) и каждого раствора гранул антитела (50X), необходимого для проведения анализа.
   3. Приготовьте раствор для коктейля, добавив рассчитанное количество каждого раствора гранул антитела, и заполните до желаемого конечного объема, добавив оставшееся количество разбавителя в гранулах. Следите за тем, чтобы конечная концентрация каждого антитела в коктейле составляла 1X. Всегда готовьте не менее 20% дополнительного объема коктейльного раствора в случае ошибок при пипетировании.
      заметка: В качестве примера, для анализа на 96 лунок приготовьте 3000 мкл раствора коктейля из гранул антител. Необходимое количество каждого раствора гранул антитела = 3000/стоковая концентрация каждого раствора гранул антитела; 3000/50 = 60 мкл каждого раствора гранул антитела
      1. Добавьте по 60 мкл каждого из 41 раствора гранул антител (60 X 41 = 2460 μл) в бутылку для коктейля и добавьте 540 μл раствора разбавителя гранул в смесь гранул антител, чтобы получить 3000 μл конечного рабочего раствора (1X).
      2. Перед использованием тщательно перемешайте раствор для коктейля из шариков. После анализа оставшийся объем хранят при температуре 2-8 ^оС до 30 дней.
   4. Подготовьте средства контроля качества (QC), добавив 250 μL деионизированной воды в запасы QC 1 и QC 2.
   5. Правильно перемешайте, перевернув бутылки несколько раз и вортексируя в течение 10 секунд. Перелейте раствор в правильно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и храните оставшийся раствор при температуре -20 ^°C, который можно использовать до 30 дней.
   6. Приготовьте буфер для стирки, добавив 270 мл деионизированной воды в 30 мл раствора буфера для промывки 10X и хорошо перемешайте (перед разбавлением доведите буфер 10X до комнатной температуры и растворите все осадки соли путем перемешивания). Храните неиспользованный буфер для стирки (1X) при температуре 2-8 ^°C, который можно использовать до 30 дней.
   7. Приготовьте стандартный запас цитокинов человека (10 000 пг/мл всех аналитов), добавив 250 мкл деионизированной воды в флакон с бульоном. Хорошо перемешайте, перевернув несколько раз и вортексируя флакон в течение 10 секунд. Дайте ему постоять 10 минут и перенесите исходный раствор в правильно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки. После проведения анализа оставшийся раствор хранить при температуре -20 ^оС, который можно использовать до 30 дней.
   8. Готовьте рабочие стандарты цитокинов человека путем 5-кратных серийных разведений (50 мкл -> 200 мкл) с буфером для анализа с получением концентраций 2000, 400, 80, 16 и 3,2 пг/мл.
   9. После подготовки стандарта используйте рабочие стандарты в течение 60 минут и используйте буфер для анализа в качестве пустого/фонового (-pg/mL).
4. Профилирование цитокинов методом мультиплексного анализа на основе гранул:
   1. Доведите все реагенты до комнатной температуры и закрутите в течение 5-10 секунд, прежде чем добавлять их в 96-луночный микротитровальный планшет. Если образцы с элюированием слезы хранятся при температуре -80 ^°C до проведения анализа, разморозьте замороженные экстракты слез на льду и центрифугируйте при 1000 X g в течение 5 минут.
   2. Подготовьте лист анализа в вертикальной конфигурации для рабочих стандартов цитокинов человека [0 (Blank), 3.2, 16, 80, 400, 2,000 и 10,000 пг/мл], QC1, QC2 и образцов.
   3. Добавьте 200 мкл промывочного буфера 1X в каждую лунку пластины, запечатайте его с помощью запайщика для пластин и держите на шейкере для тарелок при комнатной температуре (20-25 ^°C) в течение 10 минут.
   4. Сцедите буфер для стирки 1X, перевернув пластину и несколько раз наклеив ее на впитывающие полотенца, чтобы удалить остатки буфера для стирки в лунках.
   5. Добавьте по 25 мкл каждого рабочего стандарта цитокинов человека, QC1, QC2, бланк (буфер для анализа) и образцы в соответствующие лунки.
   6. Добавьте по 25 мкл буфера для анализа в каждую лунку.
   7. Добавьте 25 мкл 1X раствора коктейля из гранул антител в каждую лунку. Поскольку раствор гранул антитела чувствителен к свету, запечатайте планшет герметиком для пластин и накройте его алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света во время анализа.
   8. Выдержите тарелку при температуре 4 ^°C на ночь в шейкере.
   9. Поместите пластину на решетку для тарелок автоматической магнитной шайбы для пластин. Дайте ему постоять 1 минуту, чтобы магнитные шарики осели на дне лунки и аспирировали содержимое лунки. Добавьте 200 μл промывочного буфера на лунку, дайте ему постоять 1 минуту, а затем отасуньте содержимое лунки. Повторите стирку еще раз (для мытья тарелок следуйте инструкциям производителя набора).
   10. Добавьте 25 μл раствора антител обнаружения в каждую лунку, запечатайте планшет, накройте его алюминиевой фольгой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 60 минут на шейкере.
   11. Добавьте в каждую лунку по 25 мкл раствора стрептавидина-фикоэритрина, запечатайте пластину, накройте ее алюминиевой фольгой и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере.
   12. Поместите пластину на магнитную шайбу для пластин. Дайте ему постоять 1 минуту, а затем втяните содержимое лунки. Добавьте 200 μл промывочного буфера на лунку. Дайте ему постоять 1 минуту, а затем втяните содержимое лунки. Повторите стирку еще раз.
   13. Добавьте 150 мкл жидкости оболочки в каждую лунку и поместите планшет на шейкер на 5 минут при комнатной температуре, чтобы ресуспендировать гранулы антител.
   14. Немедленно прочитайте планшет с помощью считывателя мультиплексного анализа на основе шариков и проанализируйте концентрацию цитокинов с помощью 5-параметрического алгоритма подгонки кривой. Схематическая схема профилирования цитокинов слезы показана на рисунке 1.
5. Считывание пробирного листа (настройка прибора) и анализ данных:
   1. Включите мультиплексный пробирный ридер на основе шариков и предварительно прогрейте лазер в течение 30 минут.
   2. Запустите программное обеспечение для мультиплексного анализа на основе шариков. На вкладке «Автоматизированное обслуживание» выберите опцию «Калибровка-проверка». Вихревой пробирку каждого реагента с калибровочными и поверочными бусинами в течение 30 секунд. Поместите по 5 капель каждого реагента в предназначенные для этого лунки. Заполните предназначенные для этого резервуары деионизированной водой и 70% этанолом.

Результаты

Рисунок 1: Схематическая схема профилирования слезных цитокинов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Миллиплекс МГС человеческая цитокин/хемокиновая магнитная панель -1 комплект	Merck, США	ГКИТОМАГ-60К-41
Инструмент Flexmap 3D luminex	Luminex Corp, Остин, Техас, США
Программное обеспечение xPonent	Luminex Corp, Остин, Техас, США
Программное обеспечение RBXGenerator	BIO-RAD, Франция
Менеджер Bio-Plex 6.1	BIO-RAD, Франция
Шейкер для тарелок	Corning, США
TECAN Шайба для микропластин	Текан, Швейцария	Технология HydroSpeed
Пипетки	Mettler Toledo, CA, США
Микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	Аксиген, США	MCT-150-C
Тест-полоска Schirmer на разрыв	Eye Care and Cure, США	101657
Набор для 3D-калибровки Flexmap	Luminex Corp, Остин, Техас, США	40-028
Набор для 3D-верификации Flexmap	Luminex Corp, Остин, Техас, США	40-029
Кресло для осмотра глаз