$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Анализ цитокинов слезы
- Коллекция слез:
- Попросите испытуемого удобно сесть на стул для осмотра и прислонить его голову к подголовнику.
- Попросите испытуемого посмотреть вверх, осторожно откройте полоски Ширмера (изготовленные из фильтровальной бумаги ватмана No 41), поместите закругленный конец полоски на нижний свод глаза и попросите испытуемого закрыть глаза на 5 минут. При сборе слез будьте очень осторожны, чтобы свести к минимуму контакт с поверхностью глаза.
- Попросите субъекта открыть глаза, чтобы снять полоску и поместить ее в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Немедленно перенесите пробирку в лабораторию или храните ее при температуре -80 °C до проведения анализа на профилирование цитокинов.
- Элюирование образца слезы из полоски слезного потока:
- Разрежьте полоску отрывного потока до длины 0,5 см (чтобы нормировать количество разрывов, подлежащих испытанию) и поместите ее в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 30 мкл буфера для анализа и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин с последующим центрифугированием пробирки при 14 000 x g в течение 1 мин.
- Переложите надосадочную жидкость в другую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и выбросьте полоску. Поместите образец, содержащий пробирку, на лед и немедленно используйте образец с элюированием слезы для профилирования цитокинов.
- Приготовление реагентов:
ПРИМЕЧАНИЕ: Сорок один аналит, который должен быть протестирован в каждом образце с помощью мультиплексного анализа на основе гранул, - это интерлейкин (ИЛ)-1α, ИЛ-1β, ИЛ-Rα, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12 p40, ИЛ-12 p70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17А, интерферон-альфа (ИФН-α) 2, ИФН-γ, ИФН-гамма-индуцируемый белок 10 (IP-10, CXCL10), хемокин макрофагального происхождения (MDC), макрофагальный воспалительный белок (MIP)-1α и MIP-1β, моноцитарный хемотаксический белок (MCP)-1, MCP-3, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), TNF-β, онкоген, регулируемый ростом (GRO), фактор роста опухоли альфа (TGF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF)-2, тромбоцитарный производный фактор роста (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эотаксин, фраталкин, растворимый CD40-лиганд (sCD40L), Fms-подобная тирозинкиназа 3 лиганд (Flt-3L) и регулируемый при активации нормальный Т-клеточный экспрессируемый и секретируемый белок (RANTES).
- Доведите флаконы с раствором антител (50X) до комнатной температуры (20 – 25 oC) и переведите флаконы в течение 1 минуты.
- Подсчитайте количество лунок, необходимых для проведения анализа, и рассчитайте общее количество общего раствора коктейля из гранул антител (25 мкл на лунку) и каждого раствора гранул антитела (50X), необходимого для проведения анализа.
- Приготовьте раствор для коктейля, добавив рассчитанное количество каждого раствора гранул антитела, и заполните до желаемого конечного объема, добавив оставшееся количество разбавителя в гранулах. Следите за тем, чтобы конечная концентрация каждого антитела в коктейле составляла 1X. Всегда готовьте не менее 20% дополнительного объема коктейльного раствора в случае ошибок при пипетировании.
заметка: В качестве примера, для анализа на 96 лунок приготовьте 3000 мкл раствора коктейля из гранул антител. Необходимое количество каждого раствора гранул антитела = 3000/стоковая концентрация каждого раствора гранул антитела; 3000/50 = 60 мкл каждого раствора гранул антитела
- Добавьте по 60 мкл каждого из 41 раствора гранул антител (60 X 41 = 2460 μл) в бутылку для коктейля и добавьте 540 μл раствора разбавителя гранул в смесь гранул антител, чтобы получить 3000 μл конечного рабочего раствора (1X).
- Перед использованием тщательно перемешайте раствор для коктейля из шариков. После анализа оставшийся объем хранят при температуре 2-8 оС до 30 дней.
- Подготовьте средства контроля качества (QC), добавив 250 μL деионизированной воды в запасы QC 1 и QC 2.
- Правильно перемешайте, перевернув бутылки несколько раз и вортексируя в течение 10 секунд. Перелейте раствор в правильно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и храните оставшийся раствор при температуре -20 °C, который можно использовать до 30 дней.
- Приготовьте буфер для стирки, добавив 270 мл деионизированной воды в 30 мл раствора буфера для промывки 10X и хорошо перемешайте (перед разбавлением доведите буфер 10X до комнатной температуры и растворите все осадки соли путем перемешивания). Храните неиспользованный буфер для стирки (1X) при температуре 2-8 °C, который можно использовать до 30 дней.
- Приготовьте стандартный запас цитокинов человека (10 000 пг/мл всех аналитов), добавив 250 мкл деионизированной воды в флакон с бульоном. Хорошо перемешайте, перевернув несколько раз и вортексируя флакон в течение 10 секунд. Дайте ему постоять 10 минут и перенесите исходный раствор в правильно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки. После проведения анализа оставшийся раствор хранить при температуре -20 оС, который можно использовать до 30 дней.
- Готовьте рабочие стандарты цитокинов человека путем 5-кратных серийных разведений (50 мкл -> 200 мкл) с буфером для анализа с получением концентраций 2000, 400, 80, 16 и 3,2 пг/мл.
- После подготовки стандарта используйте рабочие стандарты в течение 60 минут и используйте буфер для анализа в качестве пустого/фонового (-pg/mL).
- Профилирование цитокинов методом мультиплексного анализа на основе гранул:
- Доведите все реагенты до комнатной температуры и закрутите в течение 5-10 секунд, прежде чем добавлять их в 96-луночный микротитровальный планшет. Если образцы с элюированием слезы хранятся при температуре -80 °C до проведения анализа, разморозьте замороженные экстракты слез на льду и центрифугируйте при 1000 X g в течение 5 минут.
- Подготовьте лист анализа в вертикальной конфигурации для рабочих стандартов цитокинов человека [0 (Blank), 3.2, 16, 80, 400, 2,000 и 10,000 пг/мл], QC1, QC2 и образцов.
- Добавьте 200 мкл промывочного буфера 1X в каждую лунку пластины, запечатайте его с помощью запайщика для пластин и держите на шейкере для тарелок при комнатной температуре (20-25 °C) в течение 10 минут.
- Сцедите буфер для стирки 1X, перевернув пластину и несколько раз наклеив ее на впитывающие полотенца, чтобы удалить остатки буфера для стирки в лунках.
- Добавьте по 25 мкл каждого рабочего стандарта цитокинов человека, QC1, QC2, бланк (буфер для анализа) и образцы в соответствующие лунки.
- Добавьте по 25 мкл буфера для анализа в каждую лунку.
- Добавьте 25 мкл 1X раствора коктейля из гранул антител в каждую лунку. Поскольку раствор гранул антитела чувствителен к свету, запечатайте планшет герметиком для пластин и накройте его алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света во время анализа.
- Выдержите тарелку при температуре 4 °C на ночь в шейкере.
- Поместите пластину на решетку для тарелок автоматической магнитной шайбы для пластин. Дайте ему постоять 1 минуту, чтобы магнитные шарики осели на дне лунки и аспирировали содержимое лунки. Добавьте 200 μл промывочного буфера на лунку, дайте ему постоять 1 минуту, а затем отасуньте содержимое лунки. Повторите стирку еще раз (для мытья тарелок следуйте инструкциям производителя набора).
- Добавьте 25 μл раствора антител обнаружения в каждую лунку, запечатайте планшет, накройте его алюминиевой фольгой и выдерживайте при комнатной температуре в течение 60 минут на шейкере.
- Добавьте в каждую лунку по 25 мкл раствора стрептавидина-фикоэритрина, запечатайте пластину, накройте ее алюминиевой фольгой и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере.
- Поместите пластину на магнитную шайбу для пластин. Дайте ему постоять 1 минуту, а затем втяните содержимое лунки. Добавьте 200 μл промывочного буфера на лунку. Дайте ему постоять 1 минуту, а затем втяните содержимое лунки. Повторите стирку еще раз.
- Добавьте 150 мкл жидкости оболочки в каждую лунку и поместите планшет на шейкер на 5 минут при комнатной температуре, чтобы ресуспендировать гранулы антител.
- Немедленно прочитайте планшет с помощью считывателя мультиплексного анализа на основе шариков и проанализируйте концентрацию цитокинов с помощью 5-параметрического алгоритма подгонки кривой. Схематическая схема профилирования цитокинов слезы показана на рисунке 1.
- Считывание пробирного листа (настройка прибора) и анализ данных:
- Включите мультиплексный пробирный ридер на основе шариков и предварительно прогрейте лазер в течение 30 минут.
- Запустите программное обеспечение для мультиплексного анализа на основе шариков. На вкладке «Автоматизированное обслуживание» выберите опцию «Калибровка-проверка». Вихревой пробирку каждого реагента с калибровочными и поверочными бусинами в течение 30 секунд. Поместите по 5 капель каждого реагента в предназначенные для этого лунки. Заполните предназначенные для этого резервуары деионизированной водой и 70% этанолом.
