Использование флуоресценции иммуно-РНК in situ для визуализации SARS-CoV-2

1. РНК-FISH SARS-CoV-2 в клетках Vero, культивируемых на покровных листах

ДЕНЬ 1

1. Фиксирующие и проникающие клетки
   1. Зафиксируйте инфицированные клетки 3,7% w/v раствором PFA в течение 1 ч в режиме ЛТ.
   2. Аспирируйте 3,7% раствор PFA и дважды промойте клетки 1x PBS.
   3. Пермеабилизируйте клетки раствором PBST в течение 10 мин при РТ с перемешиванием.
   4. Аспирируйте PBST и дважды промойте клетки 1x PBS.
2. обнаружение
   1. Аспирируйте 1x раствор PBS и дважды промойте клетки 2x SSC в режиме RT.
   2. Отсадите 2x раствор SSC и предварительно гибридизуйте образцы путем добавления не менее 300 мкл буфера для гибридизации зонда. Накройте лунки с клетками и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
   3. Приготовьте раствор зонда, добавив 1,2 пмоль смеси зондов в буфер для гибридизации зонда.
      1. Используйте 1,2 мкл зонда 1 мкМ для подготовки 300 мкл рабочего состава.
   4. Удалите раствор для предварительной гибридизации и перенесите покровные стекла в увлажненную камеру.
      1. Пипеткой нанесите 30-50 мкл раствора зонда на парапленку с образованием отдельных капель.
   5. Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 часов) при температуре 37 °C.

ДЕНЬ 2

1. Переложите покровные стекла обратно в 12-луночный планшет и удалите излишки раствора зонда, промыв в течение 4 x 5 минут 400 μл буфера для промывки зонда при 37 °C.
   заметка: В качестве альтернативы размещению 30-50 мкл аликвот на парапленку и под покровные стекла для инкубации добавьте 300 мкл раствора зонда непосредственно в покровные стекла в 12-луночном планшете. Эта процедура проще, но требует значительного количества реагентов. Перед использованием нагрейте буфер для промывки зонда до 37 °C. Рассчитайте необходимое количество буфера и переложите его в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
2. Промывайте образцы в течение 2 x 5 минут 5x SSCT в режиме RT.
3. Замените 5x раствор SSCT на 1x PBS и храните образцы при температуре 4 °C до амплификации.

3. Усиление

1. Удалите 1x раствор PBS из лунок и добавьте не менее 300 мкл амплификационного буфера в каждую лунку. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при RT.
2. Подготовьте каждую шпильку HCR (h1 и h2) путем мгновенного охлаждения нужного объема в отдельных пробирках.
   1. Для приготовления 300 мкл раствора амплификации используйте 18 пмоль каждой шпильки (например, для 300 мкл используйте 6 мкл 3 мкМ стокового раствора шпильки).
   2. Перелейте раствор шпильки в пробирки.
   3. Инкубировать при температуре 95 °C в течение 90 с.
   4. Остудить до температуры 30 минут в темноте.
3. Приготовьте смесь для шпилек, добавив охлажденные шпильками «h1» и «h2» в буфер для усиления.
4. Капли 30-50 μл шпильочной смеси нанесите на парапленку.
5. Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 ч) в темноте при RT.

ДЕНЬ 3

6. Переложите покровные стекла обратно в 12-луночный планшет и удалите излишки шпилек, промывая в течение 5 x 5 минут 5x SSCT при RT с перемешиванием.
7. Отсасывайте 5x буфер SSCT и замените его на 1x PBS.
   заметка: При необходимости используйте образцы RNA-FISH в стандартном иммунофлуоресцентном анализе с последующим окрашиванием ядер (см. раздел «Побочные
эффекты»).

4. Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах

1. Аспирируйте 1x раствор PBS и замените его на 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 0,2 мкг/мл) в 1x растворе PBS.
2. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
3. Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
4. Поместите две капли по 10 мкл монтажного носителя каждая; убедитесь, что капли достаточно отделены друг от друга, чтобы на одном предметном стекле можно было разместить два покровных стекла.
5. Удалите лишнюю жидкость, постучав по покровным стеклам по чистому полотенцу, а затем поместите их в монтажную среду с защитой от выцветания ячейками вниз.
6. Поместите установленные образцы на сухую плоскую поверхность в темноте и дайте им застыть.
7. После отверждения запечатайте края покровных стекол герметиком VALAP или лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание образцов.

2. РНК-РЫБА SARS-CoV-2 в культурах HAE

ДЕНЬ 1

1. Фиксация и пермеабилизация культуры НАО
   1. Отсадите среду и зафиксируйте инфицированные клетки с помощью 3,7% раствора PFA в течение 1 ч в режиме ЛТ.
   2. Аспирируйте 3,7% раствор PFA и дважды промойте клетки 1x PBS.
      1. Замените 3,7% раствор PFA на 1x PBS под вставкой Transwell.
   3. Выбросьте PBS и обезвожьте образцы с помощью 2 промывок по 5 минут со 100% MeOH, предварительно охлажденным до -20 °C.
   4. После второй промывки замените буфер на свежий, охлажденный MeOH для проникновения под вставку Transwell. Хранить в течение ночи при температуре -20 °C.

ДЕНЬ 2

2. Регидратация
   Регидратируйте образцы с помощью последовательности растворов MeOH/PBST (каждый в течение 5 минут) на льду: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS и 100% PBST (дважды).
   1. Промойте клетки в течение 5 минут на льду с 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Промойте ячейки в течение 5 минут на льду с 5x SSCT.
   3. Замените буфер 5x SSCT на 1x PBS.
3. обнаружение
   1. Инкубируйте клетки (внутри вкладыша Transwell) в течение 5 минут на льду со 100 мкл буфера для гибридизации зондов. Далее перенесите планшет в инкубатор на 30 минут при температуре 37 °C (предварительная гибридизация).
      заметка: Буфер для гибридизации зонда перед использованием должен быть предварительно нагрет до 37 °C. Рассчитайте необходимый объем: для одной вставки Transwell требуется 100 μл.
   2. Приготовьте раствор зонда. Поскольку на 1 мл раствора зонда требуется 4 пмоль зонда, добавьте 4 мкл 1 мкМ стокового раствора зонда в 1 мл буфера для гибридизации зонда и хорошо перемешайте><. заметка: Для обнаружения РНК используйте 100 мкл раствора зонда на каждую вставку Transwell. Оставьте раствор зонда на льду до окончания этапа предварительной гибридизации.
   3. Удалите раствор для предварительной гибридизации и добавьте раствор зонда.
   4. Инкубируйте клетки в течение ночи (12-18 ч) при температуре 37 °C.

ДЕНЬ 3

5. Удалите излишки щупа путем промывки в течение 4 x 15 минут 100 мкл буфера для промывки зонда при температуре 37 °C.
6. Промойте образцы в течение 2 х 5 минут 5-кратным SSCT на RT.
7. Замените 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при температуре 4 °C до амплификации.

4. усиление

1. Предварительно амплифицируйте образцы путем их инкубации с амплификационным буфером в течение 30 мин при RT.
2. Подготовьте каждую шпильку, охладив нужные объемы в отдельных пробирках.
   1. Для приготовления 500 мкл раствора амплификации используйте по 30 пмоль каждой шпильки (например, для 500 мкл используйте 10 мкл 3 мкМ стокового раствора шпильки).
   2. Переложите раствор шпильки в трубки.
   3. Инкубировать при температуре 95 °C в течение 90 с.
   4. Остудить до температуры 30 минут в темноте.
3. Приготовьте раствор шпильки, добавив все охлажденные шпильки в 500 мкл амплификационного буфера при RT.
4. Удалите раствор для предварительного усиления и добавьте весь раствор для шпильки.
5. Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 ч) в RT в темноте.
6. Удалите излишки шпилек путем мытья 5x SSCT в RT следующим образом: 2 x 5 мин, 2 x 15 мин и 1 x 5 мин.
7. Замените 5x раствор SSCT на 1x PBS и храните при температуре 4 °C не более 2-3 дней, или приступайте непосредственно к ядерному окрашиванию><. заметка: При необходимости используйте образцы RNA-FISH в стандартном иммунофлуоресцентном анализе с последующим ядерным окрашиванием (см. раздел 3).

5. Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах

1. Отберите 1x PBS раствор и замените его раствором DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x PBS.
2. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
3. Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
4. Поместите вырезную мембрану из вставок Transwell на 10 μл монтажной среды, предотвращающей выцветание, ячейками вверх и добавьте дополнительную монтажную среду (5 μл) к мембране.
5. Накройте мембраны покровными стеклами.
6. Отверждайте смонтированные образцы на сухой ровной поверхности в темноте.
7. После отверждения запечатайте края покровных стекол герметиком VALAP или лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание образцов.

3. Иммунофлуоресцентный анализ клеток Vero и культур НАО

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите иммунофлуоресцентный анализ на 3-й день для клеточных линий или на 4-й день для культур НАО. Используйте свой подход для каждой модели. Все отличия обозначены наглядно.

1. Отсасывайте 1x раствор PBS из лунок.
2. Блокируют образцы путем инкубации с 1% w/v бычьего сывороточного альбумина в растворе PBST в течение 30 мин при 37 °C.
3. Подготовьте первичные антитела, приготовив соответствующие разведения в блокирующем растворе, и инкубируйте.
   1. Для ячеек Vero на покровных листах:
      1. Капли (30-50 мкл) раствора антитела поместить на парапленку в камере влажности.
      2. Наложите покровные стекла на капли с антителами клетками вниз.
   2. При НАО замените блокирующее вещество во вкладышах раствором антитела (100 мкл) и инкубируйте образцы во увлажненной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте время и температуру для каждой инкубации с первичным антителом. Типичные параметры составляют 2 ч при RT или в течение ночи при 4 °C.
4. Промойте образцы в течение 3 х 5 минут с помощью PBST.
   1. Для ячеек на покровных стеклах переложите на 12-луночный планшет и добавьте раствор PBST.
   2. Для культур НАО замените раствор антитела раствором PBST.
5. Проверьте доступные источники света и фильтры для конфокального микроскопа.
6. Выбирайте вторичные антитела в соответствии с видом хозяина. Выберите параметры флуорофора (длины волн возбуждения и излучения, ширину спектра и эффективность возбуждения в зависимости от имеющегося источника света).
   заметка: Спектральные параметры могут быть смоделированы с помощью онлайн-инструментов (см. Таблицу материалов).
7. Приготовьте соответствующие вторичные растворы антител, разбавив их блокирующим раствором.
8. Инкубировать со вторичными антителами (как в 6.3), но инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
9. Промойте образцы, как описано в шаге 3.4.
10. Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах
    1. Для ячеек на покровных крышках
       1. Отсадите PBST и замените его DAPI (0,2 мкг/мл) в растворе 1x PBS.
       2. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
       3. Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
       4. Поместите покровные стекла на капли объемом 10 μл монтажной среды элементами вниз.
       5. Заклейте покровные стекла лаком для ногтей.
    2. Для культур НАО
       1. Отсадите 1x PBST и замените его DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x растворе PBS.
       2. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
       3. Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
       4. Поместите вырезные мембраны на капли объемом 10 μл монтажной среды ячейками вверх и добавьте дополнительную (5 μл) монтажную среду к мембране.
       5. Накройте мембраны покровными стеклами.
       6. Заклейте покровные стекла лаком для ногтей.

4. Конфокальная микроскопия

1. Определите дорожки, указав используемые флуорофоры.
2. Выберите режим и скорость сканирования.
3. Отрегулируйте значения мощности, усиления и смещения лазера для каждого флуорофора, сравнивая их с соответствующими отрицательными контрольными значениями: для вируса — фиктивно-инфицированных клеток; для клеточных белков — образцы, окрашенные антителами контроля изотипа от соответствующего хозяина.
4. Чтобы получить 3D-изображение, активируйте режим z-стека и установите верхний и нижний пределы. Установите размер/номер шага.
   заметка: Для получения более подробной информации о визуализации коронавируса.