$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. РНК-FISH SARS-CoV-2 в клетках Vero, культивируемых на покровных листах
ДЕНЬ 1
- Фиксирующие и проникающие клетки
- Зафиксируйте инфицированные клетки 3,7% w/v раствором PFA в течение 1 ч в режиме ЛТ.
- Аспирируйте 3,7% раствор PFA и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Пермеабилизируйте клетки раствором PBST в течение 10 мин при РТ с перемешиванием.
- Аспирируйте PBST и дважды промойте клетки 1x PBS.
- обнаружение
- Аспирируйте 1x раствор PBS и дважды промойте клетки 2x SSC в режиме RT.
- Отсадите 2x раствор SSC и предварительно гибридизуйте образцы путем добавления не менее 300 мкл буфера для гибридизации зонда. Накройте лунки с клетками и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
- Приготовьте раствор зонда, добавив 1,2 пмоль смеси зондов в буфер для гибридизации зонда.
- Используйте 1,2 мкл зонда 1 мкМ для подготовки 300 мкл рабочего состава.
- Удалите раствор для предварительной гибридизации и перенесите покровные стекла в увлажненную камеру.
- Пипеткой нанесите 30-50 мкл раствора зонда на парапленку с образованием отдельных капель.
- Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 часов) при температуре 37 °C.
ДЕНЬ 2
- Переложите покровные стекла обратно в 12-луночный планшет и удалите излишки раствора зонда, промыв в течение 4 x 5 минут 400 μл буфера для промывки зонда при 37 °C.
заметка: В качестве альтернативы размещению 30-50 мкл аликвот на парапленку и под покровные стекла для инкубации добавьте 300 мкл раствора зонда непосредственно в покровные стекла в 12-луночном планшете. Эта процедура проще, но требует значительного количества реагентов. Перед использованием нагрейте буфер для промывки зонда до 37 °C. Рассчитайте необходимое количество буфера и переложите его в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Промывайте образцы в течение 2 x 5 минут 5x SSCT в режиме RT.
- Замените 5x раствор SSCT на 1x PBS и храните образцы при температуре 4 °C до амплификации.
3. Усиление
- Удалите 1x раствор PBS из лунок и добавьте не менее 300 мкл амплификационного буфера в каждую лунку. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при RT.
- Подготовьте каждую шпильку HCR (h1 и h2) путем мгновенного охлаждения нужного объема в отдельных пробирках.
- Для приготовления 300 мкл раствора амплификации используйте 18 пмоль каждой шпильки (например, для 300 мкл используйте 6 мкл 3 мкМ стокового раствора шпильки).
- Перелейте раствор шпильки в пробирки.
- Инкубировать при температуре 95 °C в течение 90 с.
- Остудить до температуры 30 минут в темноте.
- Приготовьте смесь для шпилек, добавив охлажденные шпильками «h1» и «h2» в буфер для усиления.
- Капли 30-50 μл шпильочной смеси нанесите на парапленку.
- Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 ч) в темноте при RT.
ДЕНЬ 3
- Переложите покровные стекла обратно в 12-луночный планшет и удалите излишки шпилек, промывая в течение 5 x 5 минут 5x SSCT при RT с перемешиванием.
- Отсасывайте 5x буфер SSCT и замените его на 1x PBS.
заметка: При необходимости используйте образцы RNA-FISH в стандартном иммунофлуоресцентном анализе с последующим окрашиванием ядер (см. раздел «Побочные эффекты»).
4. Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах
- Аспирируйте 1x раствор PBS и замените его на 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 0,2 мкг/мл) в 1x растворе PBS.
- Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
- Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Поместите две капли по 10 мкл монтажного носителя каждая; убедитесь, что капли достаточно отделены друг от друга, чтобы на одном предметном стекле можно было разместить два покровных стекла.
- Удалите лишнюю жидкость, постучав по покровным стеклам по чистому полотенцу, а затем поместите их в монтажную среду с защитой от выцветания ячейками вниз.
- Поместите установленные образцы на сухую плоскую поверхность в темноте и дайте им застыть.
- После отверждения запечатайте края покровных стекол герметиком VALAP или лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание образцов.
2. РНК-РЫБА SARS-CoV-2 в культурах HAE
ДЕНЬ 1
- Фиксация и пермеабилизация культуры НАО
- Отсадите среду и зафиксируйте инфицированные клетки с помощью 3,7% раствора PFA в течение 1 ч в режиме ЛТ.
- Аспирируйте 3,7% раствор PFA и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Замените 3,7% раствор PFA на 1x PBS под вставкой Transwell.
- Выбросьте PBS и обезвожьте образцы с помощью 2 промывок по 5 минут со 100% MeOH, предварительно охлажденным до -20 °C.
- После второй промывки замените буфер на свежий, охлажденный MeOH для проникновения под вставку Transwell. Хранить в течение ночи при температуре -20 °C.
ДЕНЬ 2
- Регидратация
Регидратируйте образцы с помощью последовательности растворов MeOH/PBST (каждый в течение 5 минут) на льду: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS и 100% PBST (дважды).
- Промойте клетки в течение 5 минут на льду с 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Промойте ячейки в течение 5 минут на льду с 5x SSCT.
- Замените буфер 5x SSCT на 1x PBS.
- обнаружение
- Инкубируйте клетки (внутри вкладыша Transwell) в течение 5 минут на льду со 100 мкл буфера для гибридизации зондов. Далее перенесите планшет в инкубатор на 30 минут при температуре 37 °C (предварительная гибридизация).
заметка: Буфер для гибридизации зонда перед использованием должен быть предварительно нагрет до 37 °C. Рассчитайте необходимый объем: для одной вставки Transwell требуется 100 μл.
- Приготовьте раствор зонда. Поскольку на 1 мл раствора зонда требуется 4 пмоль зонда, добавьте 4 мкл 1 мкМ стокового раствора зонда в 1 мл буфера для гибридизации зонда и хорошо перемешайте><.
заметка: Для обнаружения РНК используйте 100 мкл раствора зонда на каждую вставку Transwell. Оставьте раствор зонда на льду до окончания этапа предварительной гибридизации.
- Удалите раствор для предварительной гибридизации и добавьте раствор зонда.
- Инкубируйте клетки в течение ночи (12-18 ч) при температуре 37 °C.
ДЕНЬ 3
- Удалите излишки щупа путем промывки в течение 4 x 15 минут 100 мкл буфера для промывки зонда при температуре 37 °C.
- Промойте образцы в течение 2 х 5 минут 5-кратным SSCT на RT.
- Замените 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при температуре 4 °C до амплификации.
- усиление
- Предварительно амплифицируйте образцы путем их инкубации с амплификационным буфером в течение 30 мин при RT.
- Подготовьте каждую шпильку, охладив нужные объемы в отдельных пробирках.
- Для приготовления 500 мкл раствора амплификации используйте по 30 пмоль каждой шпильки (например, для 500 мкл используйте 10 мкл 3 мкМ стокового раствора шпильки).
- Переложите раствор шпильки в трубки.
- Инкубировать при температуре 95 °C в течение 90 с.
- Остудить до температуры 30 минут в темноте.
- Приготовьте раствор шпильки, добавив все охлажденные шпильки в 500 мкл амплификационного буфера при RT.
- Удалите раствор для предварительного усиления и добавьте весь раствор для шпильки.
- Инкубируйте образцы в течение ночи (12-18 ч) в RT в темноте.
- Удалите излишки шпилек путем мытья 5x SSCT в RT следующим образом: 2 x 5 мин, 2 x 15 мин и 1 x 5 мин.
- Замените 5x раствор SSCT на 1x PBS и храните при температуре 4 °C не более 2-3 дней, или приступайте непосредственно к ядерному окрашиванию><.
заметка: При необходимости используйте образцы RNA-FISH в стандартном иммунофлуоресцентном анализе с последующим ядерным окрашиванием (см. раздел 3).
5. Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах
- Отберите 1x PBS раствор и замените его раствором DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x PBS.
- Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
- Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Поместите вырезную мембрану из вставок Transwell на 10 μл монтажной среды, предотвращающей выцветание, ячейками вверх и добавьте дополнительную монтажную среду (5 μл) к мембране.
- Накройте мембраны покровными стеклами.
- Отверждайте смонтированные образцы на сухой ровной поверхности в темноте.
- После отверждения запечатайте края покровных стекол герметиком VALAP или лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание образцов.
3. Иммунофлуоресцентный анализ клеток Vero и культур НАО
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите иммунофлуоресцентный анализ на 3-й день для клеточных линий или на 4-й день для культур НАО. Используйте свой подход для каждой модели. Все отличия обозначены наглядно.
- Отсасывайте 1x раствор PBS из лунок.
- Блокируют образцы путем инкубации с 1% w/v бычьего сывороточного альбумина в растворе PBST в течение 30 мин при 37 °C.
- Подготовьте первичные антитела, приготовив соответствующие разведения в блокирующем растворе, и инкубируйте.
- Для ячеек Vero на покровных листах:
- Капли (30-50 мкл) раствора антитела поместить на парапленку в камере влажности.
- Наложите покровные стекла на капли с антителами клетками вниз.
- При НАО замените блокирующее вещество во вкладышах раствором антитела (100 мкл) и инкубируйте образцы во увлажненной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте время и температуру для каждой инкубации с первичным антителом. Типичные параметры составляют 2 ч при RT или в течение ночи при 4 °C.
- Промойте образцы в течение 3 х 5 минут с помощью PBST.
- Для ячеек на покровных стеклах переложите на 12-луночный планшет и добавьте раствор PBST.
- Для культур НАО замените раствор антитела раствором PBST.
- Проверьте доступные источники света и фильтры для конфокального микроскопа.
- Выбирайте вторичные антитела в соответствии с видом хозяина. Выберите параметры флуорофора (длины волн возбуждения и излучения, ширину спектра и эффективность возбуждения в зависимости от имеющегося источника света).
заметка: Спектральные параметры могут быть смоделированы с помощью онлайн-инструментов (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте соответствующие вторичные растворы антител, разбавив их блокирующим раствором.
- Инкубировать со вторичными антителами (как в 6.3), но инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
- Промойте образцы, как описано в шаге 3.4.
- Ядерное окрашивание и монтаж на предметных стеклах
- Для ячеек на покровных крышках
- Отсадите PBST и замените его DAPI (0,2 мкг/мл) в растворе 1x PBS.
- Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
- Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Поместите покровные стекла на капли объемом 10 μл монтажной среды элементами вниз.
- Заклейте покровные стекла лаком для ногтей.
- Для культур НАО
- Отсадите 1x PBST и замените его DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x растворе PBS.
- Инкубируйте образцы в течение 10 минут при RT в темноте.
- Отсадите раствор DAPI и дважды промойте клетки 1x PBS.
- Поместите вырезные мембраны на капли объемом 10 μл монтажной среды ячейками вверх и добавьте дополнительную (5 μл) монтажную среду к мембране.
- Накройте мембраны покровными стеклами.
- Заклейте покровные стекла лаком для ногтей.
4. Конфокальная микроскопия
- Определите дорожки, указав используемые флуорофоры.
- Выберите режим и скорость сканирования.
- Отрегулируйте значения мощности, усиления и смещения лазера для каждого флуорофора, сравнивая их с соответствующими отрицательными контрольными значениями: для вируса — фиктивно-инфицированных клеток; для клеточных белков — образцы, окрашенные антителами контроля изотипа от соответствующего хозяина.
- Чтобы получить 3D-изображение, активируйте режим z-стека и установите верхний и нижний пределы. Установите размер/номер шага.
заметка: Для получения более подробной информации о визуализации коронавируса.