Все вирусы гриппа должны обрабатываться в соответствии с соответствующими требованиями уровня биобезопасности (BSL-2 или выше), как определено в Биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL).
1. Подготовка реагентов и исходного материала
- Получение клеток собачьей почечной α2,6-сиальной трансферазы Madine Darby (MDCK-SIAT1) и стерильной среды для культивирования клеток
- Приготовьте среду для культивирования клеток MDCK-SIAT1 с использованием 500 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 10% v/v инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 мг/мл сульфата G418 (например, генетикина) и 100 Ед/мл пенициллина со 100 мкг/мл стрептомицина (по желанию). Стерилизовать путем фильтрации через мембрану размером с пор размером 0,2 μM. Сульфат G418 добавляется для обеспечения стабильности плазмид в клетках MDCK-SIAT1.
- Подготовьте клеточную линию MDCK-SIAT1. В колбе (колбах)для 2-тканевых культур размером 162 см, содержащей 30 мл стерильных питательных сред для клеточных культур, колбах с 2 - 2,5 x 106 клетками MDCK-SIAT1 и инкубируют при 37 °C при 5%CO2 в течение 2 дней; это будет использоваться для определения инфекционной дозы (ТКИД) в тканевой культуре и анализов MN.
заметка: Клетки MDCK-SIAT1 были любезно предоставлены доктором М. Матросовичем, Марбург, Германия. Эту клеточную линию можно получить и в промышленных масштабах (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте стерильную среду для размножения вируса с использованием 500 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 20 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазина-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES). Стерилизовать путем фильтрации через мембрану размером с пор размером 0,2 μM.
- Приготовьте 0,75% (v/v) эритроцитов морской свинки (gpRBCs) в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01 M PBS, при pH 7,2.
- Приготовьте стерильный разбавитель вируса с использованием DMEM с высоким содержанием глюкозы, 1% бычьего альбумина фракции V (BSA), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 20 мМ HEPES. Стерилизовать путем фильтрации с помощью мембраны размером с пор 0,2 мкм и готовить свежий для каждого анализа.
- Приготовьте фиксатор холодовой камеры в виде 80% холодного ацетона в PBS (0,01 М PBS, pH 7,2).
- Приготовьте буфер для промывки с помощью PBS (0,01 М, PBS, pH 7,2) и 0,3% (v/v) tween-20.
- Приготовьте разбавитель антител с использованием PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 и 5% обезжиренного сухого молока.
- В качестве основного антитела используйте клоны мышиных моноклональных антител против гриппа А NP А1 и пул А3. Разведите в разбавителе антитела в оптимальной концентрации, определенной титрованием.
- Используйте козий антимышиный IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) в качестве вторичного антитела. Разведите в разбавителе антитела в оптимальной концентрации, определенной титрованием.
- Приготовьте пероксидазный субстрат с использованием о-фенилендиамина дигидрохлорида (ОПД) в 0,05 М фосфатцитратном буфере при рН 5. Приготовьте 0,05 М фосфатцитратный буфер, растворив 1 капсулу/100 мл деионизированного H2O. Растворите 1 таблетку OPD (10 мг)/20 мл фосфатцитратного буфера непосредственно перед применением.
- Используйте 0,5 М серной кислоты в качестве раствора для остановки OPD. Добавьте 28 мл 18 мл серной кислоты 18 М к 972 мл деионизированного H2O в химическом колпаке.
- Лечение сывороток человека и животных
- Тепло инактивируйте сыворотки крови человека, используемые в анализах MN, на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 минут до проведения анализа. Использовать немедленно или, при необходимости, хранить размороженную сыворотку при температуре 4 °C не более 24 часов; Если требуется более длительный срок хранения, храните сыворотки в замороженном виде при температуре -20 °C или холоднее.
- Сыворотки животных, используемые в анализах MN, обработайте ферментом, разрушающим рецепторы (RDE), и перед анализом подвергнуть тепловой инактивации следующим образом.
- Разморозьте сыворотки на водяной бане при температуре 37 °C, затем положите на лед. Смешайте 1 объем образца сыворотки животного происхождения с 3 объемами RDE. Выдерживать при 37 °C в течение 18 - 20 часов.
- Термическая инактивация сыворотки, обработанной RDE, при 56 °C в течение 30 мин. Добавьте 6 объемов PBS с pH 7,2 к каждому образцу для окончательного предварительного разбавления 1:10. При необходимости размороженные сыворотки хранить при температуре 4 °C не более 24 часов; Если требуется более длительный срок хранения, храните сыворотки в замороженном виде при температуре -20 °C или ниже.
заметка: Сыворотки животных могут содержать различные гликаны сиаловых кислот, которые могут связываться с гемагглютининами или ГК вирусов гриппа и ингибировать связывание специфических для гриппа анти-ГА антител. Таким образом, необходимо проводить РДЭ для всех сывороток животных до проведения анализов МН для удаления этих неспецифических вирусных связывающих ГК в образцах сыворотки.
2. Прохождение культуры клеток MDCK-SIAT1
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры должны проводиться в шкафу биологической безопасности для предотвращения заражения.
- Сцедить клеточную питательную среду из клеточного монослоя в 2 колбы по 162 см. Трипсинизируйте клетки, промывая монослой трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Добавьте 5 мл трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть монослой клеток. Инкубировать при 37 °C, 5% углекислом газе, CO2 до тех пор, пока монослой не отсоединится (5-10 минут). Добавьте 15 мл среды для культивирования клеток MDCK-SIAT1 в каждую колбу, содержащую трипсинизированные клетки, и пипетируйте вверх и вниз до отдельных клеток.
- Используйте гемоцитометр и трипановый синий, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность. Семена клеток в новые колбы для культуры тканей размером 162см2, содержащие 30 мл питательных сред для клеточных культур, с концентрацией 2-2,5 x 106 клеток/колба и инкубация при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней для использования в анализах TCID и MN. Засевают клетки при концентрации 4 - 5 x 10по 6 клеток/колбу и инкубируют при 37°C с 5%CO2 в течение 2 дней для использования в размножении вируса.
заметка: Плотность посева можно регулировать, если требуется более короткий или более длительный период культивирования. Для размножения вируса клетки должны достигать более чем 100% конфлюенции. Для анализа дозы инфекции в культуре тканей (ТКИД) и МН клетки должны находиться на уровне 75–95% конфлюенции (Рисунок 1).
3. Распространение вирусов A(H3N2) в клетках MDCK-SIAT1
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус A(H3N2) может распространяться либо в 10-11-дневных эмбриональных куриных яйцах в соответствии со стандартным протоколом, либо в клеточных культурах MDCK-SIAT1. Клетки MDCK-SIAT1 должны достигать более чем 100% конфлюенции для инокуляции вируса. Вирусные семенные материалы могут быть инокулированы многократным разведением инокулята. Разведения инокулюма с лучшим урожаем HA и инфекционностью могут быть использованы для дальнейших анализов MN.
- Культуральную среду для клеток удалить из монослоя клеток (>100% конфлюенция) в колбах по162 см. Промойте монослой дважды 15 мл стерильного 0,01 М PBS, pH 7,2 и сцедите.
- Пометьте 1 колбу как контрольную и добавьте 20 мл среды для распространения вируса. Инкубируйте колбу при 37 °C с 5%CO2. Оставьте эту колбу нетронутой и используйте ее для сравнения после 1-го дня размножения вируса.
- Добавьте 10 мл стерильной среды для распространения вируса в колбу (колбы) и инкубируйте все колбы (колбы) при 37 °C, 5% CO2. Разморозьте флакон с вирусом гриппа при комнатной температуре, затем положите на лед. Разбавить средой для распространения вируса до целевых разведений.
заметка: Целевые разведения могут быть скорректированы на основе титров HA вирусных запасов. Для приготовления разбавленного инокулюма в соотношении 1:1000 добавьте 100 мкл вируса в 9,9 мл стерильной среды для распространения вируса. Осторожно переверните, удалите 1 мл разбавления 1:100 до 9 мл стерильной среды для распространения вируса и аккуратно переверните до получения разбавленного инокулюма в соотношении 1:1000. Выложите на лед.
- Извлеките из инкубатора все колбы, кроме контрольной. Удалите среду для размножения вируса из колбы (колб) с клетками MDCK-SIAT1 и инокулируйте каждую колбу 10 мл разбавленного вируса. Инкубируйте колбы при 37 °C, 5%CO2 в течение 1 часа, вращая колбу (колбы) каждые 15 минут.
- Удалите 5 мл инокулюма из колбы (колб) и замените его 15 мл среды для распространения вируса, содержащей 1 мкг/мл трипсина, обработанного тозилфенилаланилом, хлорметилкетоном (TPCK-трипсин). Инкубировать колбу (колбы) при 37 °C, 5%CO2 в течение 16-18 часов.
- После ночной инкубации наблюдайте за колбами под 100-кратным увеличением микроскопа и ищите цитопатические эффекты (CPE) на клетках. Удалите 15-17 мл надосадочной жидкости вируса из колбы (колб) и замените ее 15-17 мл свежеприготовленной среды для распространения вируса, содержащей 2 мкг/мл TPCK-трипсина.
- Инкубируйте колбы при 37 °C, 5% CO2. Контролируйте CPE монослоя (путем сравнения с контрольной колбой с ячейками) и периодически (каждые 4 ч) проверяйте ГК с 0,75% gpRBC до сбора урожая.
- Установите 96-луночный планшет для микротитрования гиалуроновой кислоты. Добавьте 50 мкл 0,01 М PBS, pH 7,2 в лунки A2 - A12 и B2 - B12 (дубликаты), а в лунки H1 - H12 для контроля.
- Добавьте 100 мкл супернатанта вируса к А1 и А2 и выполните 2-кратное серийное разведение от А1 и В1 до А12 и В12. Выбросьте 50 μл после смешивания с A12 и B12. Добавьте 50 мкл 0,75% gpRBC в строки A, B и H.
- Постучите по тарелке и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Определение ГК надосадочной жидкости вируса путем наклона 96-луночного микротитровального планшета под углом от 45° до 60°.
- Считывание планшетов для гемагглютинации; наибольшее разведение вируса, достигающее полной гемагглютинации, считается конечной точкой титрования HA для конкретного вируса. Запишите обратную величину наибольшего разведения вируса с полным гемагглютинированием в качестве титра HA вируса.
заметка: Осевшие эритроциты в ряду H (органы управления) должны начать «работать» и под действием силы тяжести сформировать небольшую каплевидную форму. Подождите, пока эритроциты в контрольных лунках закончат работу, затем считайте кнопки эритроцитов в лунках титрования вирусов. Те, которые демонстрируют кнопки RBC и «бегут», не достигают гемагглютинации. Определить наибольшее разведение вируса, которое полностью ингибирует гемагглютинацию, в качестве конечного титра HA вируса.
- Собирайте вирус, когда ГК вирусной культуры выходит на плато или вирусная культура достигает целевого уровня ГК (например, >16 единицы ГК), но до того, как монослой клетки начнет проявлять значительный CPE.
- Центрифугируйте надосадочную жидкость вирусной культуры при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C для гранулирования клеточного мусора. Переложите осветленную надосадочную жидкость, содержащую урожай вируса, в чистую пробирку. Надосадочную жидкость, содержащую вирус, собирают в одноразовые стерильные криогенные флаконы и немедленно замораживают при температуре -70 °C или ниже.
заметка: Запасы вирусов, используемые для анализа MN, должны иметь высокий инфекционный титр и минимальное количество дефектных частиц. Минимальное разведение запасов вируса для достижения 100 TCID50/50 μL для анализа MN составляет 1:100.
заметка: Запасы вирусов, используемые в анализах MN, не следует размораживать и замораживать повторно.
4. Определение TCID вируса
- День 1: Титрование вирусов
- Разморозьте флакон с вирусом при комнатной температуре и сразу же положите его на лед.
- Протестируйте вирус при двух разных начальных разведениях: 10-2 и 10-3. Добавьте 100 мкл вируса к 9,9 мл разбавителя вируса для 10-2 разведения. Добавьте 1 мл 10-2 разведения к 9,0 мл разбавителя вируса для 10-3 разведения.
- Используя два микротитровальных планшета (планшет 1 для разведения 10-2 и планшет 2 для разведения 10-3), добавьте 100 мкл разбавителя вируса во все лунки, кроме столбца 1 96-луночного микротитровального планшета.
- Выполните 1/2log10 разведений (10-2, 10-2,5, 10-3 и т.д.). Добавьте 146 мкл вируса, начав разведение, во все лунки в столбце 1 и переведите 46 мкл последовательно из столбца 1 в столбец 11 (рис. 2). Меняйте наконечники пипеток между лунками. После смешивания в колонке 11 выбросьте кончики с разбавлением 46 μл.
- Используйте столбец 12 в качестве клеточного контроля (CC); он содержит только разбавитель вируса. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 1: Подготовка клеток MDCK-SIAT1
заметка: Монослой клеток MDCK-SIAT1 должен достигать 75 - 95% конфлюенции для анализов TCID и MN. Одна колба размером 162 см2 при 95% конфлюенции должна дать достаточно клеток для посева ~ 4 - 5 микротитровых пластин.
- Промойте 75 - 95% конфлюентный монослой 20 мл PBS для удаления FBS в питательных средах. Трипсинизируйте клетки следующим образом.
- Промойте монослой стерильным PBS, и добавьте 7 мл трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть монослой клеток. Положите колбу на плоскую поверхность и выдерживайте при температуре 37 °C, 5% CO2 до тех пор, пока монослой не отсоединится (примерно 5 - 10 минут). Добавьте 7 мл разбавителя вируса в каждую колбу, содержащую трипсинизированные клетки.
- Промойте клетки разбавителем вируса, чтобы удалить FBS.
- Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы разделить клетки. Переложите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл; Заполните пробирку разбавителем вируса.
- Центрифугируйте при 485 x g в течение 5 мин. Сцедите разбавитель вируса, замените его свежим 50 мл разбавителя вируса и центрифугируйте при 485 x g в течение 5 мин. Сцедите разбавитель вируса и замените его свежим разбавителем вируса (10 мл/колба) для ресуспендирования гранулы.
- Используйте гемоцитометр и трипановый синий, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность. Отрегулируйте концентрацию клеток с помощью разбавителя вируса до 1,5 x 105 клеток/мл.
- Добавьте 100 мкл разбавленных клеток MDCK-SIAT1 в каждую лунку микротитровальных планшетов (1,5 x 104 клеток/лунку) и накройте планшеты. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 18 - 20 часов.
- День 2: ИФА
- Фиксация клеток
- Удалите среду из микротитровальных пластин. Промойте каждую лунку 200 μл PBS. Добавьте в каждую лунку по 300 мкл холодного 80% ацетона и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут. Снимите фиксатор и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
- Элиза
- Первичное присоединение антител
заметка: Моноклональное антитело против гриппа А NP следует использовать в избытке в качестве основного антитела в ИФА. Определение оптимального разведения антител для каждой партии первичных антител путем проведения титрования антител в МН. Выберите концентрацию первичного антитела, которая является избыточной и с наилучшим соотношением сигнал/фон.
- Разбавьте моноклональное антитело против гриппа A NP (первичное антитело) до целевой концентрации в разбавителе антитела (например, добавьте 30 мкл первичного антитела к 30 мл разбавителя антитела для целевого разведения 1:1000).
- Вымойте тарелки 3 раза с 300 мкл буфера для промывки. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл разведенного первичного антитела. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Вторичное присоединение антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Козий антимышиный иммуноглобулин, IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), следует использовать в избытке в качестве вторичного антитела в ИФА. Определение оптимального разведения антител для каждой партии вторичных антител путем проведения титрования антител. Выберите избыточную концентрацию вторичного антитела и с наилучшим соотношением сигнал/фон.
- Разведите конъюгированный с антителом HRP (вторичное антитело) козий антимышиный IgG до целевой концентрации в разбавителе антитела (например, добавьте 7,5 мкл вторичного антитела к 30 мл разбавителя антитела для целевого разведения 1:4000).
- Промойте пластины 3 раза с помощью буфера для промывки объемом 300 μл. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл разведенного вторичного антитела. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Добавление подложки и чтение пластин
- Вымойте пластины 5 раз с помощью буфера для стирки объемом 300 мкл и постучите по безворсовой салфетке.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл свежеподготовленного субстрата и инкубируйте при комнатной температуре до тех пор, пока цветность не насытится, а оптическая плотность (OD) контрольных лунок клеток не достигнет <0,2.
- Добавьте 100 мкл раствора остановки во все лунки. Считывание наружного диаметра скважин на длине волны 490 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра.
- Расчет TCID 50
- Рассчитайте медианный наружный диаметр490 элементов управления ячейкой (столбец 12).
- Любую испытательную скважину с наружным диаметром490, более чем в два раза превышающим медианный наружный диаметр490 лунок CC, считают «положительной», в противном случае она считается «отрицательной».
- Рассчитайте TCID50 вируса по методу Рида-Мюнха.
- Определите количество положительных и отрицательных результатов при каждом разведении воды.
- Рассчитайте «кумулятивный положительный результат», «кумулятивный отрицательный», «коэффициент» и «% положительного», как показано в таблице 1.
- Рассчитайте «пропорциональное расстояние» между разведением, показывающим >50% положительных результатов, и разведением, показывающим <50% положительных результатов, используя следующее:
заметка: Поправочный коэффициент для 1/2 логарифмического разведения составляет 0,5. Например, в таблице 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
- Рассчитайте вирус TCID50, прибавив пропорциональное расстояние к разведению> показывающему 50% положительного.
заметка: Например, в таблице 2 TCID50 равен 10-5+(-0,25) = 10-5,25. ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ, это ТЦИД50 вируса на 100 мкл (или 10-5,25/100 мкл).
- Рассчитайте разбавление вируса. Для анализов MN разбавьте вирус до 200 TCID50/100 μL (эквивалентно 100 TCID50/50 μL на лунку).
заметка: В примере в таблице 1 1 TCID50 составляет 10-5,25 на 100 μL, а разведение для достижения 200 TCID50/100 μL составляет 1:891 на основе расчетов: 200 x 10-5,25 = 10-2,95 = 1/102,95 = 1/891
5. Анализ MN с использованием клеток MDCK-SIAT1
- День 1: Тестирование и контроль сывороток и раскладка планшетов
- Разморозьте сыворотки на водяной бане при температуре 37 °C и удалите сразу после размораживания. Аликвота количество сывороток, которое необходимо проверить; Для тестирования с одним вирусом в синглете требуется минимум 10 мкл оригинальной сыворотки. По возможности тестируйте сыворотки в дубликатах.
- Тепло инактивировать сыворотку крови человека в течение 30 минут на водяной бане при температуре 56 °C, как указано в шаге 1.12.1. Поместите сыворотку на лед после инактивации при нагревании и добавьте разбавитель вируса в сыворотку для достижения предварительного разведения 1:10.
- RDE обработать и предварительно разбавить сыворотки животных до соотношения 1:10 для использования для контроля в соответствии с 1.12.2.
заметка: Размороженные и обработанные сыворотки крови человека и животных можно хранить при температуре 4 °C не более 24 часов. Сыворотки следует хранить в замороженном виде при температуре -20 °C или ниже, если требуется более длительный период хранения до проведения анализа.
- Для тестирования с одним вирусом добавьте 100 мкл разбавленной сыворотки 1:10 в столбцы с А1 по А10 (Рисунок 3). Добавьте 50 мкл разбавителя вируса в строки от B до H, за исключением столбцов 11 и 12 (рис. 3). Выполните 2-кратное последовательное разведение из рядов A в H и отбросьте последние 50 мкл в ряду H (рис. 3).
заметка: Когда необходимо проверить несколько вирусов, сыворотки могут быть разведены в титровых пробирках. Разведение сыворотки, для определения титра сыворотки, в лунку А составляет 1:10, лунку В 1:20, лунку С 1:40, лунку D 1:80, лунку Е 1:160, лунку F 1:320, лунку G 1:640, лунку Н 1:1,280 (рис. 3).
- Для борьбы с вирусом добавьте 50 мкл разбавителя вируса в лунки A12, B12, C12 и D12 (без сывороток). Для клеточного контроля добавьте 100 мкл разбавителя вируса в лунки E12, F12, G12 и H12 (без вируса, без сыворотки).
- Для контрольных сывороток (например, контрольных сывороток хорьков) добавьте 100 мкл разбавленных контрольных сывороток в колонку А лунки А и 50 мкл разбавителя вируса в лунки В11 - Н11. Серийный разбавляют.
- Накройте планшеты крышками и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 до тех пор, пока не будет готово к присоединению вируса.
- День 1: Добавление вируса
- Разбавьте вирус до 100 TCID50/50 μL с разбавителем вируса.
- Добавьте 50 мкл разведенного вируса во все лунки, за исключением столбца 11 на планшетах для обратного титрования (BT) и контрольных лунок E12, F12, G12 и H12 на всех планшетах (рис. 3). Для планшетов с контрольными сыворотками в столбце 11 добавьте вирус в столбец 11.
- Обратное титрование (BT)
- Включите БТ в колонку 11 одного комплекта дубликатов табличек (например, табличек 1А и 1В). Добавьте 50 мкл разбавителя вируса во все лунки в колонке 11. Добавьте 50 мкл вируса в дозе 100 TCID50/50 мкл в первую лунку (А11). Перемешайте пипеткой вверх и вниз.
- Смешайте и перекачайте 50 μL в последовательные лунки для выполнения 2-кратного серийного разведения. Поменяйте наконечники пипеток между лунками, чтобы избежать переноса вируса. Выбросьте 50 мкл из лунки H11.
- Добавьте 50 μL разбавителя вируса в колонку 11, чтобы довести конечный объем до 100 μL. Постучите по планшетам для перемешивания.
- Инкубируйте планшеты при 37 °C, 5%CO2 в течение 1 ч.
- Проведите добавление клеток MDCK-SIAT1 в 1-й день и ИФА во 2-й день, как описано в шагах 4.2 и 4.3 (также описано в 5.3 и 5.4)
- День 1: Добавление клеток MDCK-SIAT1
- Подготовьте клетки MDCK-SIAT1, как описано в шаге 4.2. Добавьте 100 μл элементов MDCK-SIAT1 в соотношении 1,5 x 105 клеток/мл в каждую лунку (1,5 x 104 ячейки/лунка). Инкубируйте планшеты при 37 °C, 5%CO2 в течение 18 - 20 часов.
- День 2: ИФА
- После ночной инкубации, на вторые сутки, зафиксируйте клетки 80% холодным ацетоном, как описано в пункте 4.3.
- Добавление первичных антител
- Промойте пластины 3 раза с помощью буфера для промывки объемом 300 μл. Разбавляют моноклональное антитело против гриппа A NP (первичное антитело) до оптимальной концентрации, определенной титрованием в разбавителе антитела (например, добавляют 30 мкл первичного антитела к 30 мл разбавителя антител для целевого разведения 1:1000).
ПРИМЕЧАНИЕ: На лунку требуется 100 мкл первичного антитела. На одну пластину необходимо ~10 мл.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл разведенного первичного антитела. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Вторичное присоединение антител
- Вымойте тарелки 3 раза с буфером для промывки объемом 300 μл. Разбавьте конъюгированный с антителом HRP (вторичное антитело) козий антимышиный IgG до целевой концентрации в разбавителе антитела (например, добавьте 7,5 мкл вторичного антитела к 30 мл разбавителя антитела для мишени 1:4000).
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется 100 мкл вторичного антитела на 96 лунку. На одну пластину необходимо ~10 мл.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл разведенного вторичного антитела. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Добавление подложки и чтение пластин
- Вымойте пластины 5 раз с помощью буфера для стирки объемом 300 мкл и постучите по безворсовой салфетке.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл свежеприготовленного субстрата и инкубируйте при комнатной температуре до тех пор, пока контрольные лунки вируса не достигнут наружного диаметра490 = 0,8 - 3, при низком фоновом наружном диаметре490 <0,2.
- Добавьте 100 мкл раствора остановки во все лунки. Считывание наружного диаметра скважин на длине волны 490 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра.
- Анализ данных
заметка: Расчеты MN определяются для каждой пластины индивидуально.
- Определите титр нейтрализующих антител каждого образца сыворотки.
- Рассчитайте пороговое значение OD490 в 50% нейтрализации вирусов для каждой пластины, используя следующее уравнение:
заметка: Здесь x = 50% от порогового значения нейтрализации. Обратное разведение сыворотки крови, соответствующее наивысшему разведению с OD490 менее 50% от порогового значения (ингибирование ≥50%), считается титром нейтрализующих антител для данного образца сыворотки (рис. 4).
- Убедитесь, что контрольные лунки для клеток имеют наружный диаметр490 <0,2, а контрольные лунки для борьбы с вирусами имеют наружный диаметр490 = 0,8 - 3.
- Проверяйте инфекционность вируса в каждом анализе (100xTCID 50) по вирусу BT. Допустимый диапазон BT составляет 50, 100 или 200 TCID. При использовании того же порогового значения, которое определено на шаге 4.4.2, наибольшее разведение вируса в столбце BT с наружным диаметром выше порогового значения должно быть в лунках E11, F11 и G11,
заметка: Положительный результат в сыворотке крови должен давать титры в пределах 2 раз от значений, полученных в предыдущих тестах. OD490 отрицательного сывороточного контроля должен быть аналогичен тому, который наблюдается при контроле вируса.
