Анализ для выявления окислительного взрыва в дисках листьев арабидопсиса при иммунном выведении

Аннотация

Источник: Bredow, M., et al. Анализы окислительного взрыва и ингибирования роста рассады у Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует анализ для измерения окислительного взрыва в листьях Arabidopsis при иммунном выявлении. Листовые диски, вырезанные из листьев растений, инкубируются с бактериальными пептидами, функционирующими как микробно-ассоциированные молекулярные паттерны или MAMP. При обнаружении MAMP растительные клетки индуцируют продукцию внеклеточной АФК, которая обнаруживается с помощью хемилюминесцентного анализа.

Протокол

1. Обнаружение взрыва АФК в листовых дисках Arabidopsis после иммунного выявления

.

1. Рост и уход за растениями.
   1. Чтобы синхронизировать прорастание, стратифицируйте семена арабидопсиса, суспензив примерно 50 семян в 1 мл стерильного 0,1% агара [w/v] и храните при температуре 4 °C (без света) в течение 3-4 дней.
      заметка: Стратифицировать фоновый контроль дикого типа (например, Col-0) и генотипы с высоким и низким иммунным выходом (например, cpk28-1 и bak1-5 соответственно) для использования в качестве внутреннего контроля.
   2. Высевают семена на почву и проращивают в стандартных условиях короткого дня (22 °C, 10 ч света, 150 μE/m²/s интенсивность света и относительная влажность 65-70%).
   3. Примерно через 7 дней с помощью щипцов пересадите отдельные саженцы в новые горшки, расположенные на расстоянии не менее 4 см друг от друга, чтобы обеспечить полное развитие розеток. Пересадите по 6-12 саженцев на генотип и вернитесь к стандартным условиям короткого дня. Регулярно поливайте и удобряйте растения (1 г/л 20-20-20 удобрений каждые 2 недели).
2. Соберите листовые диски в 96-луночные пластины для восстановления за ночь.
   1. Через 4-5 недель после появления всходов (Рисунок 1A) используйте острый 4-миллиметровый биопсийный прокол для удаления одного листового диска на растении, избегая средней жилки и стараясь не ранить ее (Рисунок 1B). Поместите листовые диски в неиспользуемую 96-луночную люминометическую пластину, содержащую 100 μл двойной дистиллированной воды (ddH₂O) адаксиальной стороной вверх, чтобы предотвратить высыхание (рис. 1C). При оценке нескольких элиситоров удалите 1 листовой диск из одного листа для каждой обработки элиситором.
      заметка: Выборку листьев полностью раскинувшихся, с третьего по пятое от верхушки розетки, и примерно одинакового размера и возраста, чтобы ограничить изменчивость. Если возможно, разрежьте диски листьев пополам с помощью лезвия бритвы перед ночным восстановлением, так как это увеличивает площадь поверхности, подверженной воздействию раствора элиситора.
   2. Восстановите в течение ночи при комнатной температуре, чтобы предотвратить вмешательство АФК, вызванное ранением во время сбора листового диска. Накройте тарелки крышкой, чтобы предотвратить испарение.
3. Проведите обработку элиситором и измерьте выработку АФК.
   1. Запрограммируйте планшетный считыватель перед добавлением реакционного раствора, так как это сократит время между началом всплеска АФК и первыми зарегистрированными измерениями. Используйте коммерческое программное обеспечение, подходящее для считывателя номерных знаков. В нашем случае (см. Оглавление) нажмите «Настройки» и выберите картридж LUM96 и тип кинетического чтения. Щелкните категорию «Область чтения» и перетащите курсор, чтобы выбрать поднабор скважин или всю пластину для чтения. На вкладке PMT and Optics (Фэу и оптика) установите время интеграции равным 1 000 мс. На вкладке Время установите Общее время выполнения на 40-60 минут, а Интервал на 2 минуты.
   2. Удалите воду из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки.
      заметка: Не прокалывайте листовые диски, так как это может вызвать ранящее напряжение и привести к более переменным выходам АФК.
   3. Приготовьте реакционный раствор, содержащий 100 мкМ люминола, 10 мкг/мл пероксидазы хрена (HRP) и желаемую концентрацию элиситора (например: elf18 при 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ или 1000 нМ) в стерильном ddH₂O><, используя 10 мл раствора для одного 96-луночного планшета. заметка: Растворите лиофилизированные пептиды в стерильном_Н2О в пробирках с низкой связываемостью до 10 мМ запаса, мгновенно заморозьте в жидкости N₂ и храните при -80 °С. Когда материалы будут готовы к использованию, разбавьте их в стерильном H₂O для получения 100 мкМ рабочего состава и храните при температуре -20 °C.
   4. С помощью многоканальной пипетки подайте по 100 мкл реакционной смеси в каждую лунку, добавляя раствор на все листовые диски той же обработки одновременно. Включите контрольную реакцию (без элицитора) для каждого генотипа для оценки базальных уровней АФК в отсутствие эликвитации. Немедленное измерение светового излучения для всех длин волн видимого спектра с помощью считывателя микропланшетов.
      заметка: Готовьте и применяйте реакционный раствор при слабом освещении, так как люминол и HRP являются светочувствительными реагентами. Храните реагенты на льду или при температуре -20°C, если они не используются.
   5. Измерьте световое излучение с временем интегрирования 1 000 мс с интервалом 2 минуты в течение 40-60 минут в считывателе микропланшетов для захвата динамического окислительного взрыва (рис. 1D).
      заметка: Используйте более длительное время интеграции для повышения чувствительности анализа, гарантируя, что все образцы в 96-луночном планшете могут быть измерены в течение одного интервала.

Результаты

Рисунок 1. Анализ окислительного взрыва на основе люминола после иммунной индукции у Arabidopsis. (А) Выращивайте растения на почве в условиях короткого дня в течение 4-5 недель. (B) Используйте 4-миллиметровый биопсийный перфоратор для сбора листовых дисков с каждого растения и восстановите его в течение ночи в ddH2O. (C) Добавьте реакционный раствор (100 μМ люминол, 10 μг/мл HRP и желаемая...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
20-20-20 Удобрение	Растительный продукт	10529	Смешайте 1 г/л с водой и наносите на растения каждые 2 недели для оптимального роста.
Биопсийный пуансон 4 мм	Медицинский киоск	232-33-34-	Также можно использовать набор пробкового точильщика с площадью поверхности 0,125 см^2.
BioHit mLine Механический 12 многоканальный пипетка (30-300 мкл)	Сарториус	725240 (Английский	Можно использовать любую многоканальную пипетку, а при необходимости и одну дозатор.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	ЭЗ Биолаб	КП7211	Храните 10 мМ стокового пептида при -80C в пробирках с низким связыванием белка. После размораживания хранить 100 мкМ рабочего запаса при -20С.
щипцы	Научный центр Фишера	22-327379 (Английский)
Пероксидаза хрена	Сигма-Олдрич	П6782	Растворить в чистой воде. Хранить при температуре -20 °C в защищенном от света месте.
Люминол	Сигма-Олдрич	А8511	Раствориться в ДМСО. Хранить при температуре -20 °C в защищенном от света месте.
Базальные соли Мурисажа и Скуга	Лаборатория Седарлейн	МСП09-100ЛТ	Хранить при температуре 4С.
почва	Садоводство SunGrow	Саншайн Микс #1	Для выращивания арабидопсиса также можно использовать другие типы почв. Смешивайте с водой при наполнении кастрюль.
SpectraMax Paradigm Многорежимный считыватель микропланшетов с модулем LUM	Молекулярные приборы		Для этих анализов можно использовать любой планшетный считыватель, способный обнаруживать люминесценцию.
Белые полистирольные 96-луночные планшеты	Научный центр Фишера	Тел.: 07-200-589

шт. )