Измерение иммуноиндуцированного ингибирования роста рассады

Аннотация

Источник: Bredow, M. et al., Анализы окислительного взрыва и ингибирования роста рассады у Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Это видео демонстрирует анализ ингибирования роста рассады на растении Arabidopsis thaliana. Определено влияние повышенной концентрации иммунного пептидного элиситора на рост рассады.

Протокол

1. Анализ на ингибирование роста рассады

1. Семена простерилизовать и посеять на тарелки Мурашиге и Скуга (МС).
   1. Приготовьте стерильную среду полуконцентрации (0,5x) MS (2,16 г/л), содержащую 0,8% агара [w/v]. Разлейте фильтрующий материал по пластинам (90 x 15 мм) в колпаке с ламинарным потоком.
   2. Простерилизовать около 100 семян в микроцентрифужной пробирке, промыв 1 мл 70% этанола в течение 2 минут, и удалить с помощью аспирации. Добавьте 1 мл 40% отбеливателя и осторожно покачивайте в течение 17 минут при комнатной температуре. Удалить отбеливатель путем аспирации и трижды промыть в 1 мл стерильной воды в течение 5 минут. Ресуспендировать в 1 мл стерильного 0,1% агар.<бр/> заметка: В качестве альтернативы можно использовать протокол стерилизации семян хлором24.
   3. Посеять примерно 100 семян на каждый генотип на агаровых планшетах МС с помощью пипетки и запечатать микропористой лентой в ламинарный проточный колпак.
      заметка: Избегайте размещения семян в непосредственной близости, так как это затруднит пересадку рассады в дальнейшем.
   4. Стратифицировать семена, поместив пластины при температуре 4 °C (без света) на 3-4 дня для синхронизации прорастания (рисунок 1A).
2. Пересадите рассаду в 48-луночные планшеты, содержащие пептиды иммунных элиситоров.
   1. После стратификации переместите пластины на свет в условиях короткого дня (22 °C, 10 часов света, интенсивность света 150 μE/m²/s и относительная влажность 65-70%) в течение 3-4 дней, чтобы дать возможность прорасти.
   2. В ламинарном проточном колпаке готовят разведения элиситорных пептидов (0 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ и 1000 нМ) в стерильных жидких средах 0,5x MS, содержащих 1% сахарозы [w/v], используя 25 мл MS для каждого 48-луночного планшета. Подготавливают планшеты путем дозирования 500 мкл жидкой среды МС или среды, содержащей пептиды МС, на лунку. Если это возможно, используйте пипеттор повтора для подготовки планшетов, чтобы ускорить процесс.
      заметка: Для каждого генотипа выращивайте рассаду в рассеянном склерозе без элицитора, чтобы учесть любые внутренние различия в росте рассады.
   3. С помощью стерильных щипцов осторожно пересадите по одному саженцу в каждую лунку одинакового размера и возраста, следя за тем, чтобы рассада не пострадала или не сломалась и чтобы корень был погружен в среду. Для каждого генотипа пересадите минимум 6-8 сеянцев в каждое пептидное разведение (рис. 1В).
      заметка: Пересаживайте рассаду через 4 дня после появления всходов, так как с короткими корнями легче манипулировать, а более старые саженцы могут дать менее оптимальные результаты.
   4. Запечатайте пластины микропористой лентой и верните на свет в стандартных условиях короткого дня (22 °C, 10 часов света, 150 μE/m²/s интенсивность света и относительная влажность 65-70%). Дайте рассаде подрасти в течение 8-12 дней.

2. Определите процент ингибирования роста.

1. Аккуратно извлеките рассаду из 48-луночных пластин и просушите ее, промокнув на бумажном полотенце. Взвесьте рассаду на аналитических весах и запишите значения. Если возможно, используйте аналитические весы с USB-выходом для записи свежих значений веса в электронную таблицу. Перед тем как взвешивать рассаду, сделайте фото, чтобы наглядно отобразить торможение роста (рисунок 1С).
2. Определить процент ингибирования роста сеянцев, обработанных элицитором, по сравнению с рассадой, выращенной в РС, можно определить только следующим образом:
   
3. Стройте графики данных с помощью столбчатой диаграммы со стандартными полосами погрешностей или с помощью ящичковой диаграммы и графика с усами для лучшего отображения межэкспериментальной дисперсии.

Результаты

Рисунок 1. Анализ на ингибирование роста рассады, индуцированный элициторами, у Arabidopsis. (А) Посеять рассаду на агар МС и выращивать в течение 3-4 дней в стандартных условиях короткого дня. (B) Пересадите рассаду в 48-луночные планшеты, содержащие среду MS или MS, содержащую различные концентрации elf18. (C) Через 8-12 дней визуально оцените размер саженца, а затем измерьте свежий вес с ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
8-луночные стерильные планшеты с крышкой	Сигма-Олдрич	CLS3548
Аналитические весы с уклонным шейдом	ВВР	ВВР-225АК	Для анализа инициации роста можно использовать любую стандартную аналитическую шкалу, однако оптимальным является прямой компьютерный вывод.
BioHit mLine Механический 12 многоканальный дозатор (30-300 мкл	Сарториус	725240 (Английский	Можно использовать любую многоканальную пипетку, а при необходимости и одну дозатор.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	ЭЗ Биолаб	КП7211	Храните 10 мМ стокового пептида при температуре -80 °C в пробирках с низким содержанием белка. После размораживания храните 100 мкМ рабочего запаса при температуре -20 градусов С.
Базальные соли Мурисажа и Скуга	Лаборатория Седарлейн	МСП09-100ЛТ	Хранить при температуре 4 градуса С.
Белые полистирольные 96-луночные планшеты	Научный центр Фишера	Тел.: 07-200-589

)