ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол применим к различным тканям растений. Рисовая оболочка и листовые диски использовались в этом протоколе для обнаружения АФК при выявлении PAMP. Поскольку различия в основном возникают из-за метода отбора проб, ниже описаны только общие процедуры, а при необходимости указываются конкретные шаги.
1. Подготовка тканей и предварительная обработка
- Рисовая оболочка
- Острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием для предварительной обработки за 1 сутки до анализа АФК разрежьте оболочку из 10-дневных проростков риса на сегменты диаметром 3 мм (рисунок 1Б).
- Поместите пять сегментов оболочки в отдельную лунку 96-луночного микротитровального планшета, содержащего 100 мкл двойной дистиллированной воды (ddH2O), на 10-12 ч в темноте при температуре 25 °C, что позволит ослабить утечку ионов, связанную с раневым повреждением, и защитные реакции (рис. 2).
заметка: Забота о вертикальном положении разрезов для обеспечения постоянной площади режущей поверхности, подверженной воздействию раствора для выведения, является важным шагом на пути к получению высоковоспроизводимых результатов. Осторожно перемещайте сегменты. Не делайте лишних надрезов или ран на сегментах, которые могут быть источником отклонения данных. Как правило, каждый тест должен содержать не менее пяти повторений, так как вариация значения ROS велика. Чем больше репликаций установлено, тем надежнее данные.
- Листовой диск
- Разрежьте листовые диски (4 мм в диаметре) у 4-6-недельных растений риса с помощью биопсийного пробивного перфоратора. Всегда срезайте листовые диски из средней трети второго листа (пронумерованного сверху) главного культиватора, чтобы уменьшить вариацию данных (Рисунок 1C).
- Поместите один листовой диск в отдельную лунку 96-луночного микротитровального планшета, содержащего 100 мкл ddH2O, на 10-12 ч для предварительной обработки, что позволит ослабить реакции, связанные с ранами, поскольку они могут препятствовать индукции АФК с помощью PAMP (рис. 2).
заметка: Осторожно управляйте листовыми дисками. Не делайте лишних надрезов или ран на дисках во время эксперимента, это может привести к изменению данных. Индукция АФК в основном происходит из клеток края среза, так как поверхности тканей риса (листья или влагалища) покрыты гидрофобными слоями. Только клетки обрезанных кромок находятся в контакте с раствором для выведения (см. раздел обсуждения).
- Держите все листовые диски плавающими, абаксиальной поверхностью вверх, в лунках микротитровой пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать изменений, связанных со стороны листа.
2. Приготовление раствора для выявления
- Растворите порошок L-012 в 20 мМ (6,23 мг/мл) водном растворе с ddH2O до получения исходного раствора. Затем разбавляют исходный раствор 50 мМ Tris HCl буфером (pH 7,5) до получения рабочего раствора с конечной концентрацией 500 мкМ L-012. Перед применением стоковый раствор держать замороженным и разбавить до рабочего раствора.
- Приготовьте раствор для выведения, содержащий PAMP, L-012 и пероксидазу хрена (HRP; 10 мг/мл в ddH2O). Для раствора для выявления объемом 10 мл смешайте 9,4 мл 50 мл раствора Tris HCl (pH 7,5), 400 мкл раствора L-012, 100 мкл HRP и 100 мкл flg22 (PAMP; 10 мМ в ddH2O). Для отрицательного контроля добавьте 100 мкл ddH2O вместо PAMP.
заметка: Приготовленные элицитирующие растворы хранить при комнатной температуре, чтобы избежать холодового стресса на тканях риса. При необходимости для лечения также могут использоваться другие PAMP, такие как хитин (20 нг/мл в конечной концентрации). Поскольку L-012 светочувствительна, накройте все пробирки, содержащие раствор L-012, алюминиевой фольгой.
3. Запуск программного обеспечения и настройка протокола с помощью считывателя микропланшетов (см. Таблицу материалов)
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка параметров программного обеспечения для чтения микропланшетов занимает некоторое время. Рекомендуется подготовить машину и протокол (один клик для продолжения) перед добавлением решения для выявления.
- Запустите программное обеспечение. Нажмите кнопку «Эксперименты», чтобы создать новый протокол или использовать существующий.
- Нажмите кнопку Процедура во всплывающем окне, чтобы настроить пластину. Выберите скважины из пластины, которые будут контролироваться.
- Нажмите «Запустить кинетику», чтобы настроить общее время выполнения и интервал чтения. Установите Время выполнения на 35 минут или дольше, в зависимости от требований эксперимента. Чтобы получать показания как можно чаще, выберите «Минимальный интервал». Для времени интеграции выберите 1 с или дольше, в зависимости от интенсивности сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал чтения зависит от количества выборок и длительности интегрирования сигнала.
- Нажмите «Подтвердить» | OK для подтверждения настроек.
- Нажмите «Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программное обеспечение выдаст запрос на диалоговое окно загрузки пластины. Поместите проверяемую пластину на держатель.
- Остановитесь здесь, чтобы дождаться создания системы выявления (в следующем разделе). Как только система выявления будет готова, нажмите «Запустить», чтобы начать чтение.
4. Создание системы выявления и измерение производства АФК в реальном времени
- Осторожно удалите ddH2O из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения или высыхания тканей.
- С помощью многоканальной пипетки добавьте 200 мкл раствора для выведения в лунки, содержащие ткани.
- Аккуратно встряхните, чтобы перемешать. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать обнаружение.
заметка: При лечении PAMP растительные ткани реагируют и вырабатывают АФК очень быстро. Поэтому рекомендуется сначала лечить отрицательный контроль без PAMP, чтобы сократить время операции при нескольких обработках. Работайте как можно быстрее, чтобы сократить задержку между процедурами. Чем короче будет время между добавлением вызывающего раствора и началом обнаружения, тем лучше будет захват важных экспериментальных данных.
