Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови
- Получите цельную человеческую кровь от здорового донора или пациента с помощью венепункции с использованием вакутайнеров, содержащих антикоагулянт цитрат-декстроза кислоты (ACD) (пробирки с желтым верхом).
заметка: Цельная кровь может храниться в ACD при комнатной температуре (18-22 °C) до 36 часов, прежде чем перейти к следующему этапу. Как правило, для проведения анализа достаточно 1-2 10-мл вакутайнерных пробирок цельной крови.
- Развести цельную кровь в соотношении 1:1 об/в в теплой полной среде RPMI (RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 20 мМ HEPES и 0,01 мг/мл гентамицина).
- Выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из разбавленной цельной крови с помощью центрифугирования с градиентом плотности, как рекомендовано производителем (см. Список материалов). Разбавленную кровь очень медленно наносят слоями по градиенту плотности (нагрев до комнатной температуры, 18-22 °C).
заметка: Сведите к минимуму количество перемешивания на границе раздела для оптимального разделения крови, тщательно наслаивая смесь крови по каплям или с помощью пипетки.
- Позвольте смеси крови медленно наслаиваться на верхнюю часть градиента плотности, поместив наконечник пипетки близко к градиенту плотности и позволив смеси крови очень медленно стекать по стенке пробирки.
- В зависимости от масштаба эксперимента, слой 10 мл смеси крови поверх 3 мл градиента плотности (в пробирке объемом 15 мл) или слой 35 мл смеси крови поверх 15 мл градиента плотности (в пробирке объемом 50 мл). Как правило, из 10 мл цельной крови получается 10 миллионов PBMC, с некоторыми вариациями от донора к донору.
заметка: Очень важно, чтобы не происходило смешивания смеси крови с градиентом плотности. Смесь крови должна наслаиваться на градиент плотности и медленно подниматься, пока вся кровь не окажется на вершине градиента плотности.
- Центрифугируйте слоистую смесь при давлении 700 х г в течение 30 минут без тормозов. Центрифужируемая смесь должна быть разделена на 5 слоев (сверху вниз): плазма, охристая оболочка (содержащая PBMCs), материал градиента плотности, гранулоциты и эритроциты.
- Удалите и выбросьте большую часть плазмы и осторожно извлеките содержимое buffy coat (PBMC) в новую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки Пастера и всасывающей груши.
заметка: Удаление охристого слоя эффективно осуществляется путем применения всасывания к пипетке Пастера при выполнении круговых движений вокруг внешней стороны слоя, прижимая кончик пипетки к трубке.
- Три раза промыть выделенные PBMC в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,3 путем центрифугирования при 350 x g в течение 10 минут (при полном торможении) между промывками. Восстановите гранулу PBMC в полной среде RPMI. В зависимости от размера гранулы достаточно 3-7 мл среды.
- Подсчитайте PBMC с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Учитывайте только те клетки, которые не окрашены трипановым синим. Восстановите PBMC до 1 750 000 клеток/мл в полной среде RPMI.
- Засейте 400 μл (700 000 клеток) в каждую лунку 8-камерного предметного стекла. Инкубируйте предметное стекло в полностью увлажненном инкубаторе для культуры тканей с температурой 37 °C (с добавлением 5%CO2) в течение 1 ч, чтобы моноциты/макрофаги прилили.
2. Предварительная обработка адгезивных моноцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только при поиске способов ингибирования или усиления фагоцитоза.
- Предварительно обработайте слипшиеся моноциты любым лекарственным средством или соединением, представляющим интерес. Восстановите лекарственный препарат (препараты) или другой исследуемый материал до желаемой концентрации с использованием полной среды RPMI.
заметка: Например, 200 мкг/мл внутривенного иммуноглобулина обычно используется для 95-100% ингибирования фагоцитоза при использовании моноцитов человека.
- Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую любые неадгезивные клетки, из 8-камерного предметного стекла после 1-часовой инкубации (после шага 1.6). Замените его 400 мкл лекарственного препарата или другого средства и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C.
- При аспирации и замене растворов в 8-камерном предметном стекле обязательно контролируйте поток жидкости, чтобы слабо адгезившие клетки не отрывались. Кроме того, работайте только с 2-3 пустыми лунками за один раз и избегайте пересыхания лунок.
заметка: Как правило, каждая процедура выполняется в трех технических экземплярах.
3. Опсонизация эритроцитов R2R2
ПРИМЕЧАНИЕ: Опсонизированные R2R2 эритроциты используются в качестве положительного контроля для FcγR-опосредованного фагоцитоза. Naïve R2R2 следует хранить в растворе Альсевера (для продления срока годности) при температуре 4 °C до 1 месяца. Раствор Альсевера изготовлен на собственном производстве и состоит из 0,8% по сравнению с тринатрия цитратом (дигидрат), 1,9% по сравнению с декстрозой, 0,42% по сравнению с хлоридом натрия и 0,05% по сравнению с лимонной кислотой (моногидрат). Если клетки R2R2 недоступны, можно использовать другие резус-фенотипированные клетки, такие как R1R2, R1R1, R1r или R2r.
- Промыть эритроциты R2R2 (cDE/cDE) в PBS в общей сложности три раза, используя центрифугирование при 350 x g в течение 5 мин><.
заметка: Количество необходимых эритроцитов зависит от размера эксперимента и может быть рассчитано в обратном порядке. Всегда промывайте избыточное количество эритроцитов, так как эритроциты теряются во время каждой промывки из-за лизиса или во время удаления надосадочной жидкости. Например, в эксперименте с 5 обработками и 2 контрольными процедурами, все они проводились в технических трех экземплярах, в общей сложности имеется 21 скважина. 21 лунка с 400 мкл смеси 1,25% эритроцитов на лунку указывает на необходимость 105 мкл упакованного опсонизированного эритроцита. 200 мкл эритроцитов следует предварительно промыть и 150 мкл опсонизировать, чтобы обеспечить наличие достаточного количества эритроцитов для стадии фагоцитоза.
- Опсонизируйте промытую гранулу R2R2 поликлональными анти-D антителами 1:1 v/v из сыворотки крови человека и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C с прерывистым перемешиванием.
заметка: Если поликлональные анти-D антитела недоступны, можно использовать моноклональные анти-D антитела, которые коммерчески доступны, или анти-D, которые обычно используются для резус-иммунопрофилактики, которые могут быть получены в банках крови или службах переливания. Оптимизационные испытания должны проводиться в самом начале, при настройке анализа, а также при переключении на большое количество нетитроированных поликлональных антител или при переключении на моноклональное антитело. Это необходимо для определения оптимальной концентрации или объема анти-D, необходимого для результата теста на антиглобулин (IAT) в диапазоне от 3+ до 4+ и результата фагоцитоза в диапазоне от 70 до 90 фагоцитированных эритроцитов на 100 подсчитанных моноцитов.
- Промойте опсонированный R2R2 в общей сложности три раза в PBS с использованием центрифугирования при 350 x g в течение 5 минут каждый.
заметка: Успешная опсонизация R2R2 может быть подтверждена выполнением непрямой IAT. Вкратце, вторичные поликлональные антитела против человека добавляются для связывания первичных опсонизирующих антител на поверхностях эритроцитов, и усиленный сигнал может наблюдаться в виде гемагглютинации. Подробный протокол производителя можно найти в файле с дополнительными материалами.
- Восстановите промытые гранулы R2R2 до 1,25% v/v с использованием полной среды RPMI.
заметка: Избыток опсонизированного R2R2 может храниться в растворе Альсевера при температуре 4 °C до недели.
4. Фагоцитоз, опосредованный Fc-рецептором
- Отсадите препарат или надосадочную жидкость из 8-камерного предметного стекла и добавьте 400 мкл 1,25% v/v R2смеси. Выдерживать при 37 °C в течение 2 ч.
- Через 2 ч инкубации снимите камеры с помощью адаптеров производителя. Промокните излишки R2R2 на бумажное полотенце. Следите за тем, чтобы горка не пересыхала.
- Наполните стакан объемом 100 мл PBS. Погрузите и промойте предметное стекло, медленно перемещая предметное стекло вперед и назад (около 30-40 движений), чтобы удалить большую часть нефагоцитированного R2R2.
- Снимите предметное стекло с PBS. Промокните излишки PBS бумажным полотенцем или салфеткой и высушите предметное стекло на воздухе.
- Зафиксируйте высушенное на воздухе предметное стекло в 100% метаноле на 45 с. Затем высушите неподвижный слайд на воздухе.
заметка: Предметные стекла можно исправить с помощью другого метода, более совместимого с последующим окрашиванием, например, морилкой Грюнвальда-Гимзы21 или морилкой Райта-Гимзы.
- Установите слайд с помощью монтажного материала Elvanol собственного производства (или другого имеющегося в продаже монтажного материала) и добавьте покровные стекла.
заметка: Монтажная среда для эльванола состоит на 15% из поливиниловой спиртовой смолы и на 30% из глицерина в PBS. Смесь нагревают до тех пор, пока вся смола не растворится, а глицерин не будет однородно перемешан. Его можно заменить другим коммерчески доступным монтажным носителем.
- Дайте креплению высохнуть в течение ночи перед количественным измерением.
5. Количественная оценка фагоцитоза
- Используя фазово-контрастный микроскоп и объектив с 40-кратным увеличением, вручную количественно оцените количество фагоцитарных событий, подсчитав не менее 200 моноцитов и количество фагоцитированных R2R2 в этих моноцитах. Держите по одному счетчику в каждой руке, чтобы одновременно количественно определить количество моноцитов и количество фагоцитированных R2R2.
- Получить средний фагоцитарный индекс можно путем деления числа фагоцитированных R2R2 на количество моноцитов и умножения на 100. Выражайте данные в виде среднего (среднего фагоцитарного индекса) ± стандартной ошибки среднего (SEM).
