Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка
- Жидкость для лаважа
- Приготовьте сбалансированный раствор соли со 100 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
заметка: Для измерения уровня белка в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) рекомендуется добавлять ингибиторы протеазы, предотвращающие активность протеазы в жидкости БАЛ.
- катетер
- Сделайте катетер, вставив иглу 23 G в прозрачную пластиковую полиэтиленовую трубку 21 G (внутренний диаметр: 0,58 мм, внешний диаметр: 0,965 мм, длина: 0,5 см). Также можно использовать готовые катетеры.
- Анестетиков
- Приготовьте терминальный анестетик, предпочтительно такой, который вызывает остановку дыхания (например, барбитурат, такой как раствор пентобарбитала натрия (>100 мг/кг) в фосфатно-солевом буфере (PBS)). <бр/>
заметка: Рекомендуется использовать инъекционную анестезию вместо ингаляционной, так как ингаляционная анестезия может повлиять на содержание жидкости БАЛ. CO2, например, влияет на pH крови и, следовательно, на перераспределение различных соединений.
- Буфер для лизиса эритроцитов хлорида аммония и калия (ACK)
- Приготовьте буфер для лизиса ACK, растворив 8,29 г хлорида аммония (NH4Cl) и 1 г бикарбоната калия (KHCO3) в 1 л H2O со 100 мкМ ЭДТА; буфер для лизиса эритроцитов также можно приобрести из внешнего источника.
2. Проведение бронхоальвеолярного лаважа (BAL)
- Введение катетера в трахею
- Усыпите мышь путем внутрибрюшинного введения смертельной дозы анестетика барбитуратов короткого действия с помощью иглы 26 G. Чтобы подтвердить правильную летальную анестезию, защемите заднюю лапу мыши щипцами, чтобы проверить рефлекс стопы.
- Положите животное на спину на хирургическую пластину и зафиксируйте мышь, прижав конечности.
- Распылите 70% этанол на горлышко для дезинфекции. Сделайте надрез на коже шеи возле трахеи с помощью скальпеля.
- Откройте кожу, чтобы обнажить слюнные железы. Отделите слюнные железы с помощью клещей, чтобы обнажить стерноподъязычную мышцу. Разрежьте мышцу вокруг трахеи с помощью клещей, чтобы обнажить трахею.
- Подложите под трахею хлопчатобумажную нить с помощью клещей.
- Осторожно проколите середину обнаженной трахеи между двумя хрящевыми кольцами иглой 26 G. Будьте осторожны, чтобы не повредить трахею в дальнейшем.
- Введите катетер примерно на 0,5 см в трахею. Следите за тем, чтобы катетер не был введен слишком глубоко в трахею, так как это может привести к повреждению структуры легких.
- Стабилизируйте катетер, перевязав трахею вокруг катетера с помощью хлопчатобумажной нити, помещенной в шаге 2.1.5. Если катетер недостаточно завязан, введенный сбалансированный раствор соли может течь к верхней части дыхательных путей, а не вниз в легкие.
- Соберите жидкость для промывания
- Загрузите в шприц объемом 1 мл 1 мл стерильного сбалансированного раствора соли со 100 мкМ ЭДТА.
- Подсоедините шприц объемом 1 мл к катетеру и осторожно введите раствор соли/ЭДТА в легкое.
- Осторожно отсасывайте раствор, массируя грудную клетку мыши. Если аспиратная жидкость не видна в шприце, осторожно введите катетер немного ниже или вверх по трахее.
- Извлеките шприц из иглы и перелейте восстановленную жидкость для промывания в пробирку объемом 15 мл, помещенную на лед. Как правило, из 1 мл введенного раствора извлекается 700 - 900 мкл БАЛ.
- Повторите шаги 2.2.1 - 2.2.4 еще дважды. <бр/>
заметка: Если целью является анализ неклеточного содержания, рекомендуется концентрировать объединенные образцы при наличии проблем с чувствительностью.
3. Сбор клеточных и неклеточных компонентов жидкости BAL
- Центрифугируйте жидкость для промывания в течение 7 минут при 400 x g и 4 °C.
- Соберите надосадочную жидкость и немедленно используйте ее для дальнейшего анализа (например, иммуноферментный анализ, ИФА) или заморозьте при температуре -80 °C. Сохраните клеточную гранулу для анализа притока клеток в легкие.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл лизирующего буфера ACK.
заметка: Этот этап обеспечивает лизис эритроцитов, сохраняя при этом лейкоциты нетронутыми.
- Инкубировать в течение 2 мин при RT.
заметка: Чтобы уменьшить вариации, вызванные лизисом эритроцитов, этот шаг не следует выполнять дольше 2 минут.
- Добавьте 1 мл холодного PBS, чтобы разбавить лизирующий буфер ACK.
- Центрифугируйте в течение 7 мин при 400 x g и 4 °C. Отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в достаточном объеме PBS для последующего анализа (см. ниже).
заметка: Объем PBS зависит от проводимого ниже по технологической цепочке исследования.
4. Анализ различных типов клеток в жидкости BAL с помощью проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из возможностей - проанализировать абсолютный и относительный клеточный состав жидкости BAL с помощью проточной цитометрии. Целью данной статьи является более подробно остановка методики BAL. Проточная цитометрия сама по себе является специализированной методикой. Рекомендуется ознакомиться со специализированными работами по методике проточной цитометрии. Используются антитела, соединенные с флуорофором, которые распознают поверхностные антигены (см. Таблицу 1), специфичные для конкретного типа (типов) клеток. Используя стратегию гейтирования, можно идентифицировать Т-клетки, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, эозинофилы и нейтрофилы в клеточной фракции БАЛ.
- Окрашивание поверхности клеток
заметка: Важно включить все критические элементы управления для анализа проточной цитометрии. Необходимы три комплекта пробирок (см. Таблицу 2): (1) пробирки с образцами; (2) пробирки с БАЛ-клетками для каждого антитела-флуорофора для получения одиночных окрашиваний; Это позволяет определять напряжения для каждого канала на проточном цитометре; и (3) пробирки с шариками для каждого антитела-флуорофора для получения одиночных красителей; Это необходимо для определения матрицы компенсации.
- Сделайте смесь антител и Fc-блока (анти-CD16/CD32) в PBS в соответствующих разведениях (см. таблицу 2). Необходимо определить оптимальное рабочее разведение для каждого антитела до начала эксперимента.
- Ресуспендируйте клетки в 50 мкл смеси антител для образца и добавьте 50 мкл соответствующим образом разведенного антитела к критическому контролю.
заметка: Окрашивание может быть выполнено в 96-луночной, U-образной пластине. Это дает возможность легко уменьшить объем пятна и запустить значительное количество образцов.
- Выдерживать 30 минут в темноте при температуре 4 °C.
- Центрифугируйте в течение 7 минут при 400 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте элементы в PBS до конечного объема 200 μл<бр/>
заметка: Этот конечный объем зависит от минимального объема, к которому может получить доступ проточный цитометр. Это может немного отличаться между машинами. Кроме того, объем считывания зависит от количества клеток и/или времени, которое потребуется образцу для прохождения в проточном цитометре.
- Используйте образцы и контрольные элементы для проточного цитометрического анализа.
заметка: Чтобы определить абсолютное число клеток различных клеточных популяций, следует добавить подсчет шариков. Добавьте такое же количество бусин (± 25 000 бусин) к каждому образцу непосредственно перед измерением. Используя прямое и боковое рассеяние, счетные шарики могут быть идентифицированы с помощью проточной цитометрии (см. рис. 1). Впоследствии абсолютное число клеток в образце может быть рассчитано путем сравнения отношения событий гранул к событиям в ячейках. Можно использовать следующую формулу:
- Проточный цитометрический анализ
заметка: Проточный цитометрический анализ следует проводить сразу после завершения протокола окрашивания. Для детектирования сигнала необходимо использовать проточный цитометр с соответствующими лазерами и фильтрами. В таблице 3 представлен обзор лазеров и фильтров, необходимых для исследования, описанного в данной рукописи. Для получения дополнительной информации о проточно-цитометрическом анализе см. Adan et al..
- Установите основные ворота на основе переднего и бокового рассеивания, исключая мусор и дублеты (см. рис. 1).
- Регулируйте напряжение и компенсацию спектрального перекрытия с помощью одноокрашенных ячеек и шариков.
заметка: Эти настройки различны для каждого проточного цитометра и должны проверяться перед каждым экспериментом. Для корректного анализа потока решающее значение имеют напряжения прямого и бокового рассеяния. Правильный прямой и боковой разброс может помочь в идентификации и подтверждении идентичности анализируемых ячеек. Чтобы определить эти напряжения, сначала следует запустить неокрашенный образец.
- Настройте флуоресцентные гейты для поверхностного антигена (см. рис. 1) и проанализируйте образцы.
Таблица 1: Выбор поверхностных антигенов иммунных клеток. Эта таблица содержит список поверхностных эпитопов, используемых для характеристики различных типов клеток. Для достоверного определения конкретного типа ячейки потребуются комбинации из нескольких маркеров.
| антиген | Тип ячейки |
| Кластер дифференцировки 3 (CD3) | Экспрессируется на Т-клетках |
| Кластер дифференцировки 11c (CD11c) | Высокая экспрессия на большинстве дендритных клеток, а также на моноцитах, макрофагах, нейтрофилах и некоторых В-клетках. |
| Кластер дифференцировки 11b (CD11b) | Экспрессируется на поверхности многих лейкоцитов, включая моноциты, нейтрофилы, естественные киллеры, гранулоциты и макрофаги. |
| SiglecF | Альвеолярные макрофаги и эозинофилы. |
| MHCII | Обычно обнаруживается только на антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, мононуклеарные фагоциты и В-клетки. |
| СД19 | Антиген В-лимфоцитов |
| Ли-6Г | Маркер моноцитов, гранулоцитов и нейтрофилов |
Таблица 2. Список элементов управления, которые должны быть включены. В этой таблице приведены все необходимые средства контроля для точной интерпретации полученных результатов.
T
T
T
T
T
T
| Образцы | | | | |
| тюбик | Антиген-флуорофор для добавления в клетки | Исходная концентрация антител (мг/мл) | Разведение антител | Общий объем (μл) |
| Корректируемый краситель для повышения жизнеспособности | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| образец X | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| СД19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Ли6Г | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Регуляторы напряжения | | | | |
| тюбик | Антиген-флуорофор для добавления в клетки | Исходная концентрация антител (мг/мл) | Разведение антител | Общий объем (μл) |
| Неокрашенные клетки | / | / | / | 50 |
| Одноокрашенные элементы | Корректируемый краситель для повышения жизнеспособности | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | СД19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Одноокрашенные элементы | Ли6Г | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Управление компенсацией | | | | |
| тюбик | Антиген-флуорофор будет добавляться в гранулы | Исходная концентрация антител (мг/мл) | Разведение антител | Общий объем (μл) |
| Неокрашенные бусины | / | / | / | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | CD11c | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | SiglecF | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | MHCII | 0,2 | 1/200 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | CD3 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | СД19 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | CD11b | 0,2 | 1/400 | 200 |
| Бусины с одинарным окрашиванием | Ли6Г | 0,2 | 1/200 | 200 |
Таблица 3: Обзор лазеров и фильтров проточного цитометра, использованных в этом исследовании.
| Тип лазера | Настройка фильтра | |
| 505 ЛП | 525/50 |
| Синий (488 нм) | 550 LP | 575/26 |
| 100 мВт | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 |
| фиолетовый 405 нм | | 450/50 |
| 100 мВт | | |
| красный 633 нм | | 660/20 |
| 70 мВт | 750 LP | 780/60 |
