1. Настройка реплицирующихся и нереплицирующихся анализов MIC90
- Инокулируйте M. tuberculosis, M. bovis BCG или M. smegmatis с наружным диаметром580 0,01-0,1 и расширяйте до средней логарифмической фазы (OD580 ~0,5) в Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9, содержащий 0,2% глицерина, 0,2% декстрозы, 0,5% альбумина и 0,085% NaCl) или 7H9-OADC (Middlebrook 7H9, содержащий 0,2% глицерина и 10% добавки OADC).
- M. tuberculosis и M. bovis BCG выращивают в виде ~20 мл стоячих культур в колбах для клеточных культур и M. smegmatis с встряхиванием в полипропиленовых круглодонных (культура 4 мл) или в конических центрифужных пробирках по 50 мл (культура 10-20 мл). Патогенные микобактерии инкубируют при 37 °C с 20%O2 и 5%CO2, а M. smegmatis при 37 °C с 20%O2.
- Постановка эксперимента в стиле минимальной ингибиторной концентрации (MIC90) в условиях реплицирующихся и нереплицирующихся (рис. 1).
заметка: Испытуемые агенты обычно анализируются в дубликатах или четверках, чтобы можно было протестировать 4 или 2 соединения, соответственно, на 96-луночный микропланшет. Например, в 96-луночном планшете один испытуемый агент может быть проанализирован в строках A-D, а другой — в рядах E-H. ДМСО (носитель) указан в столбцах 1, 2 и 12, а серия разведения испытательного агента идет от столбца 3 (самая низкая концентрация) до столбца 11 (самая высокая концентрация). В анализах типа MIC90 обычно используется серия 2-кратного разведения. Для микобактерий доступно множество нереплицирующихся моделей, и в иллюстративных целях мы используем мультистрессовую модель нерепликации.
- Для реплицирующего анализа распределите 200 мкл клеток в 7H9-ADN с наружным диаметром580 0,01 во все лунки 96-луночного планшета с прозрачным дном, обработанным тканевой культурой.
- Для нереплицирующегося анализа клетки дважды промывают в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,02% тилоксапола, и ресуспендируют клетки в нереплицирующейся среде (0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4, 0,005% цитрата железа аммония, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% тилоксапола, 0,05% бутирата; pH скорректирован до 5,0 с 2 N NaOH).
- Разбавляют клетки до OD580 0,1 в нереплицирующейся среде и добавляютNaNO2 из свежеприготовленного бульона 1М до конечной концентрации 0,5 мМ.
- Распределите 200 мкл клеток с наружным диаметром580 0,1 во все лунки 96-луночного планшета с прозрачным дном, обработанным тканевой культурой.
заметка: Готовьте составные разведения в виде 100-кратных исходных растворов в ДМСО. Таким образом, для типичного планшета MIC, проверяющего воздействие молекулы при конечной концентрации 0,4-100 мкг/мл, потребуются исходные растворы 0,04-10 мг/мл в ДМСО.
- Добавьте 2 мкл разведений испытуемого агента 1 в ряды А-Е и 2 мкл разведений испытуемого агента 2 в ряды Е-Н. Тщательно перемешиваем.
- Добавьте 2 мкл управления транспортным средством (обычно ДМСО) в контрольные лунки, столбцы 1, 2, 12 (строки A-H). Тщательно перемешиваем.
- Для каждого эксперимента включайте по меньшей мере один положительный контроль, такой как рифампицин в концентрации от 0,004 до 1 г/мл (реплицирующий анализ) и/или от 0,08 до 20 мкг/мл (нереплицирующий анализ).
заметка: Использование 6-бром-1H-индазол-3-амина9 в концентрации от 0,1 до 25 мкг/мл рекомендуется в качестве контрольного соединения, обладающего селективной, NaNO2-зависимой активностью в мультистрессовой модели нерепликации.
- Для повторения анализов инкубируйте микропланшеты при 37 °C при 20%O2 и 5%CO2 в течение 7 дней (M. tuberculosis и M. bovis BCG) или 1-48 часов (M. smegmatis). Для мультистрессовой модели нерепликации инкубируйте микропланшеты в течение 7 дней при 37 °C при 1%O2 и 5%CO2 (M. tuberculosis и M. bovis BCG).
2. Инокуляция микропланшетов CARA
- В моменты времени, когда CARA будет использоваться в качестве считывателя, осторожно ресуспендируйте содержимое лунки пробирной пластины типа MIC90 с помощью многоканальной пипетки p200 объемом 50-75 мкл. Сделайте пипетку вверх и вниз не менее 5-10 раз и осторожно вращайте содержимое лунки круговыми движениями с помощью наконечников пипеток.
- Перенесите 10 мкл содержимого пробирной лунки на микропланшет CARA. Убедитесь, что порядок содержимого лунки на пробирной пластине совпадает с порядком содержимого лунки микропланшета CARA. Избегайте разбрызгивания во время переноса и убедитесь, что 10 μл находятся в середине микропланшетных лунок CARA. Убедитесь, что 10 мкл всасываются в микропланшет CARA.
заметка: Перед обнаружением пятнистых клеток на микропланшетах CARA не требуется никаких разведений.
- Обвяжите стопки микропланшетов CARA пластинчатой лентой, а затем поместите их в закрывающийся пластиковый пакет. Инкубируйте микропланшеты CARA при 37 °C с 20%O2 (M. smegmatis) или 1%O2 и 5% CO2 (M. tuberculosis и M. bovis BCG).
- Для M. tuberculosis и M. bovis БЦЖ реплицирующие анализы: инкубировать в течение 7 дней; для M. tuberculosis и M. bovis БЦЖ нереплицирующими анализами инкубировать 10 дней; для M. smegmatis реплицирующими анализами инкубировать 1-2 дня; для M. smegmatis с нереплицирующимися анализами инкубировать 2-3 ><дня
ПРИМЕЧАНИЕ: Время является приблизительным и может быть изменено соответствующим образом для различных повторяющихся, невоспроизводимых и напряженных условий.
3. Разработка микропланшетов CARA
- Развивайте микропланшеты CARA, когда на отрицательных (носительных) контрольных лунках видна пленка бактериального роста или более крупных макроскопических колоний.
заметка: После длительной инкубации лунки микропланшетов CARA часто кажутся сухими, и мы рекомендуем предварительно смачивать содержимое лунок стерильным PBS. Это служит для предотвращения поглощения резазурина древесным углем, что может привести к низкой флуоресценции или колебаниям от скважины к скважине.
- Используя один набор из 12 наконечников p200 с многоканальной пипеткой, распределите 40 мкл стерильного PBS вдоль боковых сторон лунок и позвольте PBS распределиться по верхним слоям агар/бактериальных микроколоний.
- Приготовьте проявляющий реагент CARA, смешав 5 мг резазурина (0,01% окончательного) и 50 мл 5% Tween-80 в PBS. Вихревой и стерильный фильтр.<бр/>
заметка: Альтернативный проявляющий реагент CARA может быть получен путем смешивания коммерчески приготовленного жидкого раствора резазурина в соотношении 1:1 (об/об.) с 10% Tween80 в PBS.
- Добавьте 50 мкл свежеприготовленного проявляющего реагента CARA в каждую лунку микропланшета CARA с помощью 12-канальной пипетки. Несколько раз переведите каменные плиты вперед и назад, чтобы распределить реагенты по агару и бактериальному мату в каждой лунке.
- Поместите планшеты в закрывающийся пластиковый пакет и инкубируйте при температуре 37 °C в течение не менее 30 минут для M. smegmatis и 45-60 минут для M. tuberculosis или M. bovis BCG.
заметка: Если контрольные колодцы автомобиля не становятся розовыми в течение первого часа, пластины можно повторно упаковать в мешки и инкубировать в течение более длительных периодов времени.
- Перед считыванием показаний флуоресценции поместите микропланшеты CARA в биозащитный колпак на 15 минут при комнатной температуре, сняв крышки. При использовании спектрофотометров BSL3 вне шкафа биобезопасности наклейте на пластину наклейку оптического качества ПЦР и плотно запечатайте, аккуратно надавливая на поверхность наклейки мягким бумажным полотенцем.
- Определение флуоресценции с помощью верхнего считывания с возбуждением на длине волны 530 нм и излучением на длине волны 590 нм. Заболачивать тарелку не нужно.
