1. Подготовка сред и реагентов
- Подготовьте среду для фибробластов. Смешайте 450 мл модифицированной Eagle medium (DMEM) от Dulbecco, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл пенициллина/стрептомицина. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
- Приготовьте репортер макрофагов питательных сред в 50 мл аликвот. Смешайте 45 мл DMEM, 5 мл FBS, 5 мкг/мл реагента для элиминации микоплазмы (Таблица материалов) и 200 мкг/мл флеомицина D1 (Таблица материалов). Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
- Подготовить репортер для макрофагального анализа среды в 50 мл аликвот. Смешайте 45 мл DMEM, 5 мл термоинактивированного FBS (HI-FBS), 5 мкг/мл реагента для элиминации микоплазмы и 200 мкг/мл флеомицина D1. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
2. Покрытие поверхностей клеточных культур полиметилметакрилатом)
- Растворите полиметилметакрилат (ПММА) в хлороформе в концентрации 20 мг/мл (например, 100 мг ПММА в 5 мл хлороформа) в стеклянном сцинтилляционном флаконе объемом 20 мл. Поместите в флакон магнитную мешалку и дайте перемешать не менее 2 часов, пока все твердые вещества не растворятся.
осторожность: Хлороформ вреден при вдыхании. Обязательно используйте растворитель в вытяжном шкафу, надев перчатки ПВА.
- Пипеткой нанесите 400 мкл раствора ПММА на центр микроскопа из боросиликатного стекла, вставьте предметное стекло в спин-коатер и вращайте со скоростью 3000 об/мин в течение 2 мин. Подготовьте необходимое для анализа количество предметных стекол, а также дополнительно 3−5 для измерения угла контакта с водой. Храните предметные стекла в чистой коробке (распыленной и протертой 70% этанолом) для дальнейшего использования.
заметка: Центрифуга часто используется для нанесения тонкого однородного покрытия на плоскую поверхность. Прядильная установка для нанесения покрытий вращается на подложке с высокой скоростью, используя центробежную силу для распределения раствора покрытия по поверхности.
- Измерьте угол контакта с водой в двух случайных положениях на поверхности предметных стекол с дополнительным покрытием (т.е. не стекол, используемых для культивирования клеток) с помощью гониометра, чтобы убедиться, что поверхность стекла полностью покрыта полимером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения угла контакта с водой следует использовать только воду самой высокой чистоты (например, стеклянную тройную дистилляцию).
- В шкафу биологической безопасности (BSC) прикрепите 8-камерные липкие лунки к предметным стеклам, покрытым ПММА, с помощью стерильных щипцов и следуя асептической технике. Сильно надавите на верхнюю часть липких лунок, чтобы убедиться, что они надежно прикреплены. Инкубируйте предметные стекла с прикрепленными липкими лунками при температуре 37 °C на ночь, чтобы закрепить уплотнение.
- Проверьте герметичность липких лунок, добавив в каждую лунку 200 μл воды для клеточных культур (без эндотоксинов). Инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 60 минут и убедитесь в отсутствии утечки, прежде чем продолжить. Аспирируйте воду, стараясь не повредить покрытие из ПММА.
- Промывайте воду без эндотоксинов, добавляя 300 μл воды, не содержащей эндотоксинов, в каждую лунку и инкубируйте в течение 1 часа (три раза), 12 часов и 24 часа перед использованием, чтобы удалить остатки растворителя.
- Проверьте концентрацию эндотоксина в предметных стеклах, которые будут использоваться для культивирования клеток. Инкубируйте 200 мкл воды без реагентов без эндотоксинов (Таблица материалов) в одной лунке каждого предметного стекла в течение 1 ч. Измерьте концентрацию эндотоксина в экстракте с помощью конечного хромогенного анализа эндотоксинов (Таблица материалов).
заметка: Следующий протокол относится к набору для анализа на эндотоксины, указанному в Таблице материалов.
- Используйте для этой работы только воду и расходные материалы (т. е. наконечники для пипеток, микроцентрифужные пробирки и планшеты для лунок), которые сертифицированы как не содержащие пирогены (т. е. эндотоксины). Кроме того, перед использованием любая стеклянная посуда, используемая для подготовки поверхностей с полимерным покрытием, должна быть депирогенирована с помощью стерилизации сухим жаром (250 °C в течение 30 минут). Измерение эндотоксина в растворе экстракта, как описано здесь, может привести к недооценке эндотоксина на поверхности материала. Следовательно, при разработке протокола полимерного покрытия рекомендуется проводить реакцию анализа эндотоксина (т.е. этапы 2.6.4−2.6.6 для тестовых образцов [реагентной воды] или контроля спайков) непосредственно в лунках, содержащих образец с покрытием, чтобы гарантировать непреднамеренное попадание источников эндотоксина в систему в процессе нанесения покрытия.
- Принесите все исследуемые образцы (т.е. экстракты) и реагенты для анализа эндотоксинов в RT. Восстановите хромогенный реагент в буфере для анализа и стандартный эндотоксин в воде реагента, дайте раствориться в течение 5 минут и аккуратно взболтайте перед использованием. Накрывайте все бутылки парафиновой пленкой, когда они не используются.
- Создание 5−8-точечной стандартной кривой разведения стандарта эндотоксина в диапазоне от нижней до верхней границы анализа путем выполнения серийного разведения стандарта эндотоксина в воде реагента.
- Для контроля усиления или ингибирования анализа эндотоксина в испытуемых образцах подготовьте положительный контроль (также называемый спайковым контролем или спайковым образцом) путем разбавления известного количества эндотоксина в неиспользованном растворе испытуемого образца><.
заметка: Концентрация положительного контроля должна быть такой же, как и стандартная концентрация в середине стандартной кривой. Если восстановленное количество эндотоксинового шипа (т.е. концентрация положительного контроля минус концентрация неспайкового исследуемого образца) находится в пределах 50−200% от номинальной концентрации эндотоксинового шипа, можно считать, что экстракционный раствор не оказывает существенного влияния на анализ.
- Добавьте 50 мкл стандартов, образцов или контрольных образцов в каждую лунку 96-луночного планшета в двух или трех экземплярах. Используйте реагентную воду в качестве отрицательного контроля.
- Добавьте 50 μL хромогенного реагента в каждую лунку. Быстро добавляйте реагент во все лунки. Используйте таймер, чтобы зафиксировать количество времени, необходимое для добавления реагента во все лунки. Накройте планшет клейкой пломбой и инкубируйте при температуре 37 °C (время инкубации зависит от партии и указано в сертификате анализа, входящем в комплект хромогенных реактивов). В качестве альтернативы проверяйте на планшете каждые 15 минут во время инкубации до тех пор, пока во всех стандартных лунках не будет наблюдаться изменение цвета.
- После инкубации добавьте 25 мкл 50% уксусной кислоты в каждую лунку (конечная концентрация 10% уксусной кислоты на лунку), чтобы остановить реакцию. Добавляйте уксусную кислоту в том же порядке, в котором был добавлен хромогенный реагент. Считывайте поглощение пластины с помощью считывателя пластин с длиной волны 405 нм. Асасируйте жидкость и выбросьте пластину.
заметка: Добавление уксусной кислоты должно занимать столько же времени для добавления в каждую лунку, сколько потребовалось для добавления хромогенного реагента (± 30 с).
- Ультрафиолетовое (УФ) стерилизование предметных стекол в течение 30 минут перед экспериментами по культивированию клеток.
3. Получение лизата из клеток 3T3
- Выращивайте клетки 3T3 в нескольких колбах T150 до 70% конфлюенции. Чтобы отделить клетки, аспирировать среду, промойте поверхность 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и аспиратируйте PBS. Добавьте 5 мл рекомбинантного фермента диссоциации клеток животного происхождения (Таблица материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 3−5 минут.
- Отделите ячейки, осторожно наклоняя колбу вперед и назад. Добавьте 5 мл PBS для нейтрализации рекомбинантного фермента, используемого для диссоциации клеток. Переложите отделенные клетки из колб в центрифужную пробирку и перемешайте с помощью пипетирования. Проведите подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра и красителя для определения жизнеспособности клеток.
заметка: Фермент диссоциации клеток, который может быть нейтрализован путем разведения в PBS, был выбран таким образом, чтобы избежать введения белков на основе сыворотки в препарат лизата. Если трипсин используется для диссоциации клеток, его следует нейтрализовать раствором, содержащим сыворотку, и провести дополнительную промывку PBS для уменьшения количества сывороточных белков, переносимых в препарат лизата.
- Центрифугируйте клетки при давлении 200 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в исходном объеме (т.е. 10 мл x количество колб) PBS, чтобы смыть остатки среды. Повторять.
- Снова центрифугируйте клетки при давлении 200 x g в течение 5 минут и отсасывайте надосадочную жидкость. Добавьте объем PBS, необходимый для достижения конечной концентрации клеток 1 x 106 клеток/мл. Поместите раствор ячейки в морозильную камеру при температуре -80 °C до полного замерзания образца (не менее 2 часов).
- Разморозьте раствор ячейки на водяной бане при температуре 37 °C. После полного размораживания поместите раствор обратно в морозильную камеру при температуре -80 °C до полного замерзания. Повторите в общей сложности 3 цикла замораживания-размораживания.
- Проведите анализ микробицинхониновой кислоты (ВСА) на лизате клеток при различных разведениях (например, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) для определения концентрации белка. Разбавьте лизат клеток до концентрации белка 468,75 мкг/мл, аликвоту, и храните при -80 °C для дальнейшего использования><.
заметка: Конечная концентрация белка в 48-луночном планшете составляет 125 мкг/см2 (исходя из площади поверхности одной лунки 0,75см2).
- Проведите вестерн-блоттинг для оценки наличия DAMP в лизате (например, белка теплового шока 60 [HSP60], бокс группы высокой подвижности 1 [HMGB1]) путем загрузки 40−60 мкг белка лизата в загрузочном буфере на 10% полиакриламидный гель толщиной 1,5 мм и следуйте стандартным процедурам вестерн-блоттинга.
4. Оценка влияния адсорбированных белковых слоев и толл-подобных рецепторов на активность NF-κB макрофагов
ПРИМЕЧАНИЕ: Схему экспериментального рабочего процесса и компоновки пластин см. на рисунках 1A и 2 соответственно.
- Вырастите репортерные макрофаги в колбе соответствующего размера до 70% конфлюенции. Асасируйте среду, промойте поверхность PBS и отсадите PBS. Добавьте фермент диссоциации рекомбинантных клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 8 минут.
- Отделите ячейки, сильно постучав по стенкам колбы. Инактивировать фермент диссоциации рекомбинантных клеток, добавив равный объем питательной среды (содержащей 10% FBS). Проведите подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра и красителя для определения жизнеспособности клеток.
заметка: Ожидаемая жизнеспособность репортерных макрофагов после 8-минутной инкубации в ферменте диссоциации клеток составляет 90%.
- Центрифугируйте клетки при 200 х г в течение 5 мин. Асасируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в исходном объеме PBS для промывания клеток. Снова центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в концентрации 7,3 x 105 клеток/мл в пробирной среде (содержащей термоинактивированный FBS).
- Разделите клеточную суспензию на 3 разные пробирки: ингибитор TLR4, анти-TLR2 и необработанный. Инкубируйте клетки с ингибитором TLR4 в концентрации 1 г/мл в течение 60 мин при ЛТ или с 50 мкг/мл анти-TLR2 в течение 30 мин при ЛТ.
- Добавьте 200 мкл лизата, 10% FBS, 10% коммерческой мышиной плазмы (Таблица материалов) или смесь растворов белка в 48-луночный планшет (или эквивалент) и дайте белку адсорбироваться при 37 °C в течение желаемого периода времени (т.е. 30 мин, 60 мин или 24 ч). Отсасывайте белковые растворы из лунок, используя свежую пипетку Пастера для каждого белкового раствора, и промывайте поверхности 250 μл PBS в течение 5 мин. Аспиратируйте PBS. Повторите в общей сложности 3 стирки.<бр />
заметка: Этот шаг может потребоваться начать раньше в протоколе в зависимости от желаемого времени адсорбции. Соответствующим образом настройте протокол.
- После инкубационного периода с ингибитором TLR4 или анти-TLR2 пипетки клеток для ресуспенда. Добавьте по 200 мкл раствора ячейки в каждую лунку.
- Для определения TLR2-положительного контрольного состояния добавьте Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) до конечной концентрации 150 нг/мл. Для положительного контрольного состояния TLR4 добавьте липополисахарид (ЛПС) до конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 20 часов.
- Образец 20 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки и планшета в двух экземплярах в 96-луночный планшет. Включите три лунки по 20 мкл пробирных сред в качестве фонового контроля. Добавьте в каждую лунку по 200 мкл ререпортерного реагента SEAP. Накройте планшет клейким уплотнением и выдерживайте в течение 2,5 ч при температуре 37 °C.
заметка: Время инкубации может варьироваться в зависимости от условий эксперимента и должно быть оптимизировано для обеспечения сильной разницы в поглощении между положительными и отрицательными контрольными лунками.
- Переложите оставшуюся часть надосадочной жидкости в пробирку объемом 1,5 мл (на лунку). Центрифугируйте при давлении 1 000 x g в течение 10 минут, чтобы удалить любой мусор. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл и храните при температуре -80 °C. Проанализируйте надосадочную жидкость на наличие провоспалительных цитокинов (например, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерлейкина 6) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
- Снимите пломбу с клейкой пластины. Считывайте поглощение пластины с помощью считывателя пластин с длиной волны 635 нм. Асасируйте жидкость и выбросьте пластину.
