1. Генерация CAR-кодирующего лентивируса
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как конструирование Т-клеточной плазмиды специфического химерного антигенного рецептора (CAR) завершено (CD47 и другие), лентивирусные CAR генерируются стандартной процедурой, используя 293 FT-клетки, лентивирусную упаковочную смесь и трансфективные агенты (см. Таблицу материалов), как описано. Затем с помощью набора для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и термоамплификатора (см. Таблицу материалов) определяют титр вируса путем измерения количества лентивирусной РНК в соответствии с протоколом производителя. Важно, чтобы все лентивирусные процедуры проводились строго с соблюдением требований безопасности.
- Посадите 15 x 106 HEK293FT клеток в модифицированную среду Дульбекко Eagle's Media (DMEM) и инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в одной чашке 150 мм внутри увлажненного инкубатора с содержанием 5% углекислого газа (CO2).
- Приготовьте две пробирки по 15 мл с трансфекционным комплексом. Первая пробирка содержит ДНК плазмиды лентивирусного вектора (5 мкг) и упаковочную смесь лентивируса (22,5 мкг) в 2,5 мл раствора трансфекционного разведения. Вторая пробирка содержит 82,5 мкл реагента для трансфекции в 2,5 мл раствора для разведения трансфекции (см. таблицу материалов).
- Пипетируйте содержимое пробирки 1 в пробирку 2 и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Переложите содержимое пробирки по каплям в чашку с HEK293FT клетками и инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 °C в увлажненном 5% инкубаторе с содержанием углекислого газа CO2.
- На следующий день замените существующую среду на 19 мл свежей питательной среды DMEM и продолжайте инкубировать клетки в течение ночи внутри увлажненного инкубатора с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C.
- Переложите среду из чашки в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Храните тюбик с вируссодержащей средой в холодильнике.
- Повторите вышеописанную процедуру, добавив свежий ДМЕМ и снова собрав его через 1 день.
- Соедините два сбора сред в одну центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при давлении 2 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
- Перенесите большую часть содержащей лентивирус надосадочной жидкости в ультрапрозрачную центрифужную пробирку. Оставьте минимальный объем, около 1 мл надосадочной жидкости, чтобы не повредить гранулу, которая может содержать клетки и/или мусор.
- Ультрацентрифугирование вышеосветленного надосадочной жидкости при 110 000 x g в течение 100 мин при 4°С.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость и аккуратно добавьте 100 μл среды DMEM в вирусную гранулу на дно пробирки. Оставьте тюбик на льду на 15 минут. Аккуратно перемешайте раствор и разложите раствор лентивируса по предварительно охлажденным стерильным пробиркам. Храните эти пробирки с вирусами в морозильной камере при температуре -80 °C.
- Используйте набор для количественной ОТ-ПЦР для определения титра лентивируса в соответствии с протоколом производителя, который извлекает и измеряет лентивирусную РНК.
2. Генерация и расширение CAR-Т-клеток
- Активируйте ранее замороженные мононуклеарные клетки периферической крови человека (примерно от 1 x 106 до 2 x 106 клеток) в 1 мл среды CAR T-клеток с равным количеством микрогранул, покрытых CD3/CD28 (см. Таблицу материалов) и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 24 ч.
- Разморозьте аликвоту челентивирусного запаса на льду.
- Добавьте 1 мкл агента, усиливающего трансдукцию, в лунку с клетками и перемешайте.
- Добавьте в клетки лентивирус при кратности инфекции (MOI) 5:1 и аккуратно перемешайте. На следующий день повторите этот шаг (через 24 часа после первой трансдукции).
- Следите за ростом Т-клеток каждые 2-3 дня. Добавьте больше свежей среды CAR T-клеток, чтобы поддерживать плотность клеток от 1 x 106 до 2 x 106 клеток/мл.
- Замораживание CAR-Т-клеток осуществляется по стандартному протоколу с использованием замораживающего раствора (см. Таблицу материалов).
- Разморозьте CAR-T-клетки стандартным методом и предварительно культивируйте их в среде CAR T-клеток в течение примерно ~2-4 ч с интерлейкином-2, IL-2 (300 ЕД/мл) перед их применением в анализе.
3. Определение экспрессии CAR с помощью проточной цитометрии
- Перенесите 3 x 105 CAR-Т-клеток и нетрансдуцированные Т-клетки в две отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 300 x g в течение 2 мин и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера для сортировки клеток, активируемого флуоресценцией (FACS), содержащего 1% человеческой сыворотки.
- Нанесите 100 мкл клеточного раствора в две полистирольные пробирки FACS объемом 5 мл и подержите пробирки на льду в течение 5 минут.
- Добавьте 1 мкл биотинилированного козьего антимышиного F(ab')2 в одну пробирку каждого типа клеток. Затем добавьте 2 мкл фикоэритрина, меченного ПЭ антитела против меток (см. Таблицу материалов) в другую пробирку каждого типа клеток. Хорошо перемешайте и выдержите их на льду в течение 30 минут.
- Промойте ячейки 3 мл буфера FACS в каждой пробирке и центрифугируйте пробирки при давлении 300 x g в течение 5 минут; очень быстро выбросьте надосадочную жидкость и вихрь или кратковременно встряхните пробирки, чтобы повторно суспендировать клетки в остаточной жидкости.
- Добавьте в каждую пробирку 2 мкл анти-CD3 антигенпрезентирующих клеток (APC) и 2 мкл раствора антитела 7-аминоактиномицина D (7-AAD) (см. Таблицу материалов). В пробирку клеток, окрашенных анти-F(ab')2 Ab, добавить 1 мкл стрептавидина, меченного ПЭ. Быстро перемешайте и выдержите трубки на льду еще 30 минут.
- Используйте буфер FACS для повторной промывки ячеек, как описано в шаге 3.5, и добавьте еще 200 мкл буфера FACS в каждую пробирку.
- Используйте проточную цитометрию для анализа клеток, сначала стробируя Т-клетки на графике прямого рассеяния против бокового рассеяния, а затем стробируя на живых клетках (7-AAD-отрицательных) на графике CD3 против 7-AAD. Последним шагом является анализ анти-тегов, анти-ScFv или анти-F(ab')2 в сравнении с CD3.
4. Анализ активности цитолиза в реальном времени (RTCA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте анализ RTCA в соответствии с условиями, рекомендованными производителем. Вкратце, сначала тарелируют целевые клетки в лунках E-Plate, а затем добавляют CAR-T-клетки на следующий день. Активность CAR-T-клеток в процессе цитолиза по отношению к клеткам-мишеням контролируется в режиме реального времени. Т-клетки и фиктивно-трансдуцированные Т-клетки (Mock CAR T-клетки) используются в качестве контроляторов негативных эффекторных клеток. Следующий протокол описывает анализ активности цитолиза in vitro в реальном времени для адгезивных опухолевых клеточных линий.
- Добавьте 100 μL целевой среды для культивирования клеток в каждую лунку xCELLigence E-Plate, поместите планшет внутрь прибора xCELLigence и снимите фоновые показания. Затем перенесите E-Plate в колпак для культуры тканей для посева клеток.
- Используйте стандартный протокол для трипсинизации раковых клеток-мишеней из культивального устройства. Затем переложите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте свежую питательную среду, до 15 мл. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 5 минут при 200 x g. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 5 мл свежей среды и с помощью серологической пипетки аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу. Посчитайте плотность живых клеток с помощью гемоцитометра и микроскопа.
- Отрегулируйте плотность ячеек соответствующим образом, а затем добавьте по 100 л клеточной суспензии в каждую лунку E-Plate. Число клеток-мишеней обычно составляет около 10 000 клеток/лунку для адгезивных клеточных линий (BxPC3, Hela-CD19 и SKOV3) или 30 000 клеток/лунку для суспензионных клеток, таких как Raji (см. ниже подробную информацию о предварительном покрытии лунок антителами для связывания жидких раковых клеток).
- Уравновесьте E-Plate при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы ячейки равномерно расположились на дне лунки (это очень важно; не пропускайте этот шаг).
- Поместите E-Plate в прибор xCELLigence внутри инкубатора для клеточных культур и начните автоматически измерять импеданс, отображаемый в виде зависимости клеточного индекса от времени, каждые 15 минут.
- На следующий день готовят эффекторные CAR-Т-клетки. Обязательно подготовьте соответствующие контрольные элементы (т.е. имитацию CAR-T-клеток, нетрансдуцированные контрольные Т-клетки и/или неродственные CAR-Т-клетки) заранее, чтобы убедиться, что все клетки готовы одновременно. Отрегулируйте эффекторные ячейки и контрольные ячейки до нужной плотности и приготовьте серийные разведения, чтобы обеспечить достижение желаемых соотношений E:T при добавлении 100 мкл суспензии эффекторных клеток в каждую лунку на этапе 9.
- Приостановите сбор данных xCELLigence и перенесите E-Plate из инкубатора в колпак для клеточных культур.
- Удалите по 100 мкл среды из каждой лунки. Количество остаточной среды в каждой лунке теперь составляет 100 мкл.
- Добавьте 100 мкл последовательно разбавленных эффекторных CAR-Т-клеток или других контрольных клеток (т.е. имитационных CAR-Т-клеток) для достижения желаемого соотношения E:T.
- Уравновесьте E-Plate при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы эффекторные клетки остыли, а затем поместите E-Plate обратно в инструмент xCELLigence. Возобновление сбора данных.
- При желании в ключевые моменты времени сбор данных xCELLigence может быть приостановлен, а планшет снят для сбора небольших образцов для анализа с помощью ортогональных анализов (т.е. измерения продукции цитокинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или проточной цитометрии).
- В эксперименте EGFR-GITR-CD3 с CAR T-клетками измерьте выход интерферона-гамма (IFNγ) с помощью набора ELISA (следуйте инструкциям производителя; см. Таблицу материалов).
заметка ОТНОСИТЕЛЬНО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЖИДКИХ РАКОВЫХ КЛЕТОК: Для тестирования неадгезивных гематологических раковых клеток, перед добавлением клеток, лунки E-Plate сначала покрываются антителом, специфичным для антигена, экспрессирующегося на поверхности раковых клеток. Для клеточной линии Raji B используется реагент на основе анти-CD40 (см. набор для жидкого анализа на уничтожение опухолей в Таблице материалов). Ниже приведен порядок нанесения покрытия на плиту:
- Разбавьте реагент для привязки (анти-CD40) с буфером для привязки до концентрации 4 г/мл.
- Работая внутри кожуха для культуры тканей, добавьте 50 μL разбавленного реагента для привязки в каждую лунку E-Plate. Оставьте E-Plate при комнатной температуре или в инкубаторе при температуре 37 °C на 3 часа.
- Снимите реагент для привязки и промойте E-Plate не менее 2 раз с помощью буфера для промывки. На этом этапе E-Plate готова к засеиванию целевых клеток Raji (30 000 ячеек на лунку).
- Перейдите к шагу 4.1 (выше), чтобы выполнить оставшуюся часть процедуры.
