Метод in vitro для определения антиапоптотической активности антител против TNFα

Аннотация

Источник: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. Определение относительной активности моноклонального антитела (mAb) против TNF путем нейтрализации TNF с использованием биоаналитического метода in vitro. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод оценки эффективности антител против фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), воспалительного цитокина, с помощью биоаналитического подхода in vitro. TNFα при введении в клетки, подвергшиеся стрессу, запускает апоптоз. Однако связывание с антителами ограничивает TNFα, предотвращая апоптоз. Степень апоптоза количественно определяется с помощью биолюминесцентного анализа.

Протокол

1. Подготовка среды и растворов

1. Приготовьте питательную среду: RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), pH 7,4.
2. Приготовьте питательную среду для анализа: RPMI-1640 без фенола красного, но с 1% FBS, pH 7,4.
3. Приготовьте раствор для промывки клеток: раствор Дульбекко фосфатно-солевого буфера (DPBS) без Mg и Ca с 0,02% ЭДТА, pH 7,4.
4. Приготовьте раствор для отслоения клеток: 0,125% трипсин с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
   1. Разморозьте 100 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и переложите в стерильную колбу объемом 500 мл.
   2. Смешайте со 100 мл раствора для промывки клеток и распределите по 15 мл аликвот в стерильные пробирки объемом 15 мл. Хранить при температуре от -70 до -80 °C до использования.
   3. Отфильтруйте эти растворы через мембрану толщиной 0,22 мкм и нагрейте до 37 °C в течение не менее 30 минут перед использованием.
5. Готовят апоптозно-индукционный стоковый раствор раствора TNFα в концентрации 3,3 мкг/мл.
   1. Растворите 20 г TNFα с 500 μл стерилизованной фильтром воды в первичной емкости и перемешайте до полного растворения.
   2. Переложите в стерильную пробирку объемом 15 мл и добавьте в эту пробирку 5,5 мл раствора DPBS без Mg и Ca. Аккуратно перемешайте с помощью вихревого миксера.
   3. Разложите раствор на порции по 70 μл. Дозируйте каждую аликвоту в микропробирки объемом 0,5 мл и храните при температуре -80 °C.
6. Приготовьте раствор для индукции апоптоза: раствор TNFα в концентрации 40 нг/мл.
   1. Разморозьте аликвоту индукционного стокового раствора для апоптоза, инкубируя его на водяной бане при температуре 25 °С в течение 10 мин.
   2. Разбавьте индукционный стоковый раствор апоптоза до 40 нг/мл путем добавления 61 мкл 3,3 мкг/мл раствора TNFα к 4,939 мл питательной среды для анализа в стерильной пробирке объемом 15 мл.
   3. Перемешивайте вихревым миксером в течение 10 секунд, этот раствор должен быть приготовлен свежим перед использованием.
   4. Нагрейте раствор до 37 °C в течение не менее 30 минут перед использованием в анализе нейтрализации.
7. Приготовьте раствор субстрата: раствор каспазы 3/7 Glo.
   1. Разморозьте буферный раствор каспазы (буфер каспазы 3/7 Glo) в течение 12 часов перед использованием.
   2. Перед смешиванием дайте буферному раствору каспазы и субстрату (субстрату каспазы 3/7 Glo) постоять отдельно при температуре 25 ± 5 °C.
   3. Перенесите 10 мл буферного раствора каспазы во флакон с субстратом и перемешайте методом инверсии.
   4. Хранить при температуре 25 ± 5 °C, светозащищенном до использования.
      заметка: Раствор стабилен в течение 6 ч при комнатной температуре.

2. Культивирование и подсчет клеток

1. Размораживание клеток и первая субкультура.
   1. Достаньте один флакон с ячейками WEHI 164 из морозильной камеры при температуре -80 °C и перенесите их на ледяную баню.
   2. Пипетируйте вверх и вниз 1 мл предварительно подогретой питательной среды до полного оттаивания замороженных клеток.
   3. Раздайте 9 мл предварительно подогретой питательной среды на стерильную пробирку объемом 15 мл.
   4. Переложите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 15 мл и осторожно перемешайте пять раз методом инверсии.
   5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 125 x g в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и разукрупните клеточную гранулу.
   6. Добавьте в пробирку 5 мл питательной среды. Перемешивайте до полного суспензирования ячеек.
   7. Для подсчета клеток перенесите 50 мкл клеточной суспензии в микропробирку объемом 500 мкл и смешайте с 50 мкл 0,4% трипанового синего. Подсчитайте ячейки и отрегулируйте их до 0,5 x 10⁶ клеток/мл. Смотрите шаг 2.2 ниже.
   8. Добавьте 13 мл предварительно подогретой питательной среды в колбу для клеточных культур объемом 75 мл.
   9. Дозируйте достаточный объем клеточной суспензии на шаге 2.1.6 для достижения 0,5 x 10⁶ клеток/мл в колбе для клеточных культур и инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи.
2. Подсчет клеток.
   1. Используя раствор из шага 2.1.6, перенесите 0,05 мл в гемоцитометр и определите плотность клеток под микроскопом с помощью исключения трипанового синего.
   2. Количественно оцените общее количество клеток и жизнеспособных клеток.
   3. Отрегулируйте суспензии клеток до 0,5 x 10⁶ клеток/мл.<бр/> V_{культура medium}(mL) =
      V_{культуральная среда} (мл) = (5 мл -_{суспензия V клеток})
      V_{культуральная среда} (мл) = скорректированный объем клеточной суспензии WEHI 164
      NVC = Количество жизнеспособных WEHI 164 клеток/мл<бр /> V_{культуральная среда} (мл) = объем питательной среды для анализа, добавленный к клеточной суспензии для получения 0,5 x 10⁶ клеток
      0,5 x 10⁶ = Плотность целевых ячеек
3. Отслойка клеток и вторая и третья субкультуры.
   заметка: Для удаления растворов из колб можно использовать вакуумную систему. Можно использовать одноразовые или стеклянные стерильные пипетки. Если пипетка имеет ватный засор в верхней части, его необходимо удалить перед использованием.
   1. Извлеките питательную среду из Т-образной колбы для клеточной культуры с помощью стерильной пипетки объемом 1 мл и вакуума.
   2. Нанесите 5 мл раствора для промывки клеток в Т-образную колбу для культуры, осторожно перемешайте и выбросьте раствор. Повторите этот шаг дважды.
      заметка: Полное удаление питательной среды имеет решающее значение для эффективной отслойки клеток.
   3. Добавьте в Т-образную колбу 15 мл раствора для отсоединения клеток и дайте постоять 3 минуты в инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
   4. Убедитесь в отсутствии прикрепленных клеток во внутренней стенке колбы под микроскопом. Извлеките клетки из культуральной Т-колбы с помощью стерильной пипетки объемом 20 мл и распределите их в стерильную пробирку объемом 50 мл.
   5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 125 х г в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу еще 5 мл питательной среды.
   6. Подсчитайте клетки и добавьте достаточное количество питательной среды для достижения желаемой концентрации клеток в соответствии с уравнением 1.
   7. Добавьте эту суспензию в Т-образную колбу диаметром 72 см 2 и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2.
   8. Субкультивируйте клетки не менее двух раз перед использованием их в анализе нейтрализации. Повторяйте шаги 2.3.1-2.3.8 в течение следующих двух дней.
4. Суспензия клеток анализа.
   1. Выберите субкультуру WEHI 164, которая имеет как минимум три прохода. Смотрите шаг 2.1.
   2. Отсоедините и подсчитайте ячейки в соответствии с шагами 2.2 и 2.3 данного протокола.
   3. Разбавляют клеточную суспензию в соответствии с уравнением 1 до 0,5 х 10⁶ кл/мл.
   4. Используйте эту клеточную суспензию для анализа нейтрализации. Перед применением смешайте все клеточные суспензии с помощью вихревого миксера.

3. Получение антител и разведения

1. Количественное определение мАб.
   1. Определение концентрации эталонного вещества, контрольного образца и аналитического образца путем поглощения ультрафиолета при длине волны 280 нм с использованием их массового коэффициента экстинкции (1,39).
      заметка: Исходные концентрации могут быть взяты из этикеток лекарственных препаратов. Однако это должно быть подтверждено поглощением ультрафиолета.
2. Разведения mAb.
   1. Разведите все образцы независимо друг от друга в трех экземплярах раствором DPBS без Mg и Ca в микропробирках объемом 2 мл, до 2 мг/мл. Подтвердите эту концентрацию поглощением ультрафиолета в трех экземплярах, используя раствор DPBS без Mg и Ca в качестве заготовки.
   2. Перемешайте исходные белковые растворы в течение 5 секунд с помощью вихревого миксера.
   3. Развести 100 мкл каждого раствора 2 мг/мл мАТ с 0,9 мл питательной среды для анализа.
   4. Перемешиваем в течение 5 с вихревым миксером.
      заметка: Эти растворы имеют концентрацию 200 мкг/мл. Разведения необходимо делать для каждого тройного.
   5. Развести 10 мкл каждого 200 мкг/мл mAb раствора 0,99 мл питательной среды. Перемешивайте в течение 5 с с помощью вихревого миксера. Эти растворы имеют концентрацию 2 мкг/мл. Выполняйте серийные разведения для каждого трипликата перед их использованием в анализе нейтрализации.
   6. Проводите анти-TNFα mAb разведения в трех независимых микропланшетах. Сделайте дубликат из каждой самостоятельной тройки и распределите их по одной микропластине, как указано в таблице 1. Эталонное вещество
   7. Выполните разведение mAb для каждого эталона, образца или контроля, как показано в таблице 2.
      заметка: Концентрации mAb анти-TNFα, описанные в этой таблице, не являются конечными концентрациями в анализе нейтрализации.
   8. Держите пластины при температуре 25 ± 5 °C до использования.

4. Анализ нейтрализации с помощью клеток WEHI 164

1. Перемешивайте путем вортексирования всех клеточных суспензий (0,5 x 10⁶ клеток/мл) перед дозированием на любом этапе данного протокола.
   заметка: В этой секции нагрейте каждый раствор до 37 °C в течение 30 минут перед использованием.
2. Перенесите по 50 мкл клеточной суспензии в каждую из 60 лунок микропланшетов, перемещаясь от столбца 2 к столбцу 11 и от линии B к G.
3. Перенесите 50 мкл эталонных, пробных и контрольных разведений mAb в микропланшеты. Следуйте схеме, изображенной на рисунке 1.
4. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора для индукции апоптоза.
5. Используйте клеточный контроль 50 мкл WEHI 164 клеток, дозированных в трех лунках. Доведите каждую лунку до конечного объема 150 мкл с помощью питательной среды для анализа.
6. Используйте контроль цитотоксичности смеси из 50 мкл клеток WEHI 164 плюс 50 мкл раствора для индукции апоптоза. Доведите каждую лунку до конечного объема 150 мкл с помощью питательной среды для анализа.
7. Для контроля TNFα используйте 50 мкл раствора для индукции апоптоза и доведите его до 150 мкл с помощью питательной среды.
8. Для заготовки используйте только 150 мкл питательной среды для анализа.
9. Заполните оставшиеся лунки 150 μл питательной среды, чтобы избежать эффекта испарения в пластинах.
10. Повторите шаги 4.1.1-4.1.9 дважды на двух других микропланшетах.
    заметка: Конечные концентрации мАТ в микропланшете составляют: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 и 0,004 г/мл.
11. Загрузите образцы в микропланшеты, как показано на рисунке 1
12. Инкубируйте три планшета при 37 °C и 5%_CO2 в течение 16 ± 2 ч.
13. Перед применением дайте реагенту каспазе 3/7 Glo постоять при температуре 25 ± 5 °C в течение 30 минут.
14. Добавьте 100 мкл этого реагента во все лунки, включая образцы и контроль.
15. Встряхните пластины с помощью вихревого миксера на микропластинах в течение 3 минут при температуре 25 ± 5 °C сразу после дозирования в лунки.
16. Инкубировать планшеты в течение 2,5 ± 0,5 ч при температуре 25 ± 5 °C, защищенном от света месте.
17. Вставьте микропластины в люминометр и выполните следующий раздел.

5. Анализ результатов

1. Используя программное обеспечение для определения люминесценции, выберите режим люминесценции и функцию конечной точки.
2. Выберите 96-луночный планшет со свободным дном и его 80 внутренних лунок, исключая столбцы 1 и 12.
3. Выберите время интегрирования 1 250 мс и 10 с для смешивания микропланшета перед считыванием.
4. Выберите скважины, в которые будут помещены эталонное вещество, аналитическое вещество и контрольная проба, и идентифицируйте их с соответствующими концентрациями.
5. Считайте образцы, помещенные в микропланшеты, с помощью люминометра.
6. Используйте уравнение четвертого параметра для анализа результатов. График кривой "доза-реакция", как показано на рисунке 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В уравнении четвертого параметра C является эффективной концентрацией 50 (EC50). Это значение будет использоваться для сравнения эталонного вещества, аналитического образца и контрольного образца с помощью эффекторной функции.
7. Для расчета относительных потенций зафиксируйте эталонное вещество на 100%, рассчитайте потенции образца и контролируйте соответственно.
   заметка: Эти значения показаны на рисунке 3.

Таблица 1: Массивы образцов микропланшетов. Полный анализ нейтрализации должен быть проведен на трех микропланшетах в пределах координат от B2 до G11. Случайное распределение референсных, аналитических и контрольных образцов позволяет исследователям проверить любую погрешность в анализе.

Плита 1		Пластина 2		Пластина 3
Уэллс	образец	Уэллс	образец	Уэллс	образец
В2:В11	Эталонное вещество	В2:В11	Контрольный образец	В2:В11	Аналитический образец
С2:С11		С2:С11		С2:С11
Д2:Д11	Аналитический образец	Д2:Д11	Эталонное вещество	Д2:Д11	Контрольный образец
Е2:Э11		Е2:Э11		Е2:Э11
F2:F11	Контрольный образец	F2:F11	Аналитический образец	F2:F11	Эталонное вещество
G2:G11		G2:G11		G2:G11

Таблица 2: Анти-TNFα mAb разведения. Серийные разведения mAb анти-TNFα показаны в этой таблице. Конечные концентрации, описанные в этой таблице, не являются концентрациями в анализе, где mAb против TNFα были разбавлены в 3 раза (разведение mAb + питательная среда + суспензия клеток). Жирным шрифтом выделены линии 3, 5, 7, 9 и 10; Линии, не выделенные полужирным шрифтом, представляют собой разбавление от строк 3, 4 и 6. Эти серийные разведения проводятся непосредственно перед проведением анализа нейтрализации. Необходимо соблюдать осторожность при смешивании, делая пипетирование вверх и вниз три раза перед дозированием разведений.

г.

Пластинчатая колонна	Объем питательной среды (μл)	Объем эталонного вещества, аналитической или контрольной пробы (мкл)	Концентрация в пробирной пластине (нг/мл)
2	0	230	2000
3	150	150 из строки 2	1000
4	75	75 из строки 3	500
5	100	50 из строки 3	333
6	75	75 из строки 4	250
7	75	75 из строки 5	166
8	75	75 из строки 6	125
9	75	75 из строки 7	83
10	75	75 из строки 9	41
11	150	75 из строки 10	13

Результаты

Рисунок 1: Расположение образцов в пробирных пластинах. B1 - G11 являются хорошими координатами в микропланшетах и описывают места, где размещаются разведения проб. Отсутствующие координаты – лунки, заполненные контрольными и пробирными культуральными средами (А1-А12 и Н1-Н12). Такое случайное распределение образцов (прямое и обратное разведение в микропланшетах) помогает устранить смещение в результ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ВЕХИ 164	АТКС	КРЛ-1751	Клетки фибросаркомы из musus musculus
RPMI-1640 Средний	АТКС	30-2001	Хранить в среде при температуре от 2 °C до 8 °C
RPMI 1640 Средний, без фенола красного	GIBCO	11835-030	Хранить в среде при температуре от 2 °C до 8 °C
Трипсин-ЭДТА (0,25%),фенол красный	GIBCO	No 25200-056	Хранить в среде при температуре от -10 °C до -20 °C
DPBS, без кальция, без магния	GIBCO	14190-136	Хранить в среде при температуре от 2 °C до 8 °C
Рекомбинантный человеческий белок TNF-альфа	Системы НИОКР	210-ТА-020	Хранить при температуре от -20 °C до -70 °C
Фетальная бычья сыворотка (США), сверхнизкий уровень IgG	ГиКлон	SH3089803	Хранить при температуре от -10 °C до -20 °C
Фетальная бычья сыворотка (США), охарактеризована	ГиКлон	SH3007103	Хранить при температуре от -10 °C до -20 °C
Набор для анализа Caspase-Glo 3/7	Компания Promega	Г8093	Храните субстрат Casspase-Glo. 3/7 и буфер Casspase-Glo. 3/7 при температуре –20 ºC в защищенном от света месте.
ЭДТА, Динатриевая соль, Дигидрат, Кристалл, Реагент A.C.S.	Джей Ти Бейкер	8993-01	--
Образец mAb Адалимумаб	Пробиомед	NA	Конечные концентрации в микропланшете составляют: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 и 0,004 г/мл
Референтный и контрольный mAb Адалимумаб	Аббви	NA	Конечные концентрации в микропланшете составляют: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 и 0,004 г/мл
Считыватель микропланшетов	Молекулярные приборы	89429-536	SpectraMax M3 Многорежимный
Программное обеспечение для считывателя микропланшетов	Молекулярные приборы	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
инкубатор	Ревко	No 30482	Revco RNW3000TABB CO2 с принудительной подачей воздуха
Ламинарный колпак	Компания Бейкер	200256	Бейкер SG603A-HE | Высокая эффективность, класс II тип A2

гг.