1. Производство наивных MoDC
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы цельной крови были получены от одного теленка, свободного от патогенов, путем пункции яремной вены гепаринизированными вакутайнерами (для этого исследования использовались восемь пробирок с кровью объемом 9 мл). Транспортируйте кровь в холодильнике. Храните образцы при температуре 2-4 °C для последующего использования или обрабатывайте их сразу. Следите за вращением крови, чтобы избежать свертывания крови. Простерилизуйте вакутайнеры 70% этанолом. Все последующие эксперименты проводились с одним биологическим образцом и шестью техническими повторами.
- Центрифугирование с градиентом плотности для выделения PBMC из гепаринизированной крови
- Хорошо перемешайте кровь, перевернув ее в 10 раз.
- С помощью пипетки объемом 10 мл перенесите 20 мл гепаринизированной крови в стерильную пробирку объемом 50 мл и разбавьте ее 10 мл фосфатно-физиологического буфера (PBS).
- Пипетка 15 мл среды для выделения лимфоцитов в стерильную пробирку объемом 50 мл.
заметка: Перед пипетированием дайте изолирующей лимфоциты среде нагреться до комнатной температуры.
- Наклоните пробирку объемом 50 мл, содержащую среду для выделения лимфоцитов, в положение 45°. Направьте кончик пипетки объемом 25 мл перпендикулярно и осторожно нанесите 30 мл PBS крови поверх изоляционной среды лимфоцитов, не смешивая их. Очень медленно верните пробирку объемом 50 мл в вертикальное положение.
- Центрифуга при 800 × g в течение 35 мин при 20 °C с максимальным ускорением и без торможения (функция замедления отключена).
- С помощью пастеровской пипетки соберите слой PBMC (тонкий белый слой сразу после первого слоя плазмы) и перенесите его в новую пробирку объемом 50 мл.
заметка: Центрифугирование с градиентом плотности разделяет цельную кровь на разные слои. В результате эритроциты оседают на дне в виде гранул, мононуклеарные клетки (ПМК) оседают на границе раздела, а плазма образует верхний слой. Гранулоциты находятся между гранулой и слоем PBMC.
- Промойте собранные PBMC 2 раза, добавив PBS до объема 40 мл и тщательно перемешав пипетированием вверх и вниз. Затем центрифугируйте при 500 × g при 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и максимальным замедлением.
- Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, повторно суспендируйте гранулу в 15 мл 1x аммоний-хлоридно-калий-калийного буфера (ACK) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-15 мин.<бр/>
заметка: Не выдерживайте инкубацию более 15 минут. Коммерчески доступный буфер ACK используется для обеспечения лизиса остаточных эритроцитов (эритроцитов), присутствующих во фракции PBMC.
- Добавьте PBS до объема 40 мл, а затем центрифугируйте при 500 × g и 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и замедлением.
- Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и повторите шаг 1.1.9.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл готовой питательной среды (при комнатной температуре).<бр/>
заметка: Полная питательная среда состоит из клеточной питательной среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина.
- Магнитная сепарация CD14+/-клеток из популяции PBMC с помощью CD14-конъюгированных магнитных шариков
- Подсчитайте клетки счетчиком чистых клеток гемоцитометра, используя 10 мкл клеточной суспензии, смешанной с 10 мкл раствора трипанового синего (0,4%)<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипановый синий краситель является токсичным химическим веществом и потенциальным канцерогеном. Во избежание контакта с отходами следует обращаться в средствах индивидуальной защиты (СИЗ), а отходы следует выбрасывать в герметичный специализированный контейнер для токсичных отходов. Мертвые клетки будут казаться синими, в то время как живые клетки будут казаться прозрачными под микроскопом.
- Центрифуга в течение 7 мин при 500 × г.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в буфере для сортировки клеток, активируемом флуоресценцией (FACS), используя объем 40 μL на каждые 1 ×10 7 клеток. Тщательно перемешайте с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS состоит из 2% FBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), растворенных в PBS.
- Добавьте 5 мкл микрогранулированного буфера CD14 на 1 × 107 клеток и тщательно перемешайте с помощью пипетки.
- Инкубировать в течение 30 мин при 4-8 °C для положительного отбора моноцитов крупного рогатого скота CD14+. Вихрь каждые 15 минут в течение инкубационного периода.
- Дополнительный этап (для анализа проточной цитометрии): Добавьте 10 мкл антитела, окрашивающего CD14-FITC (флуоресцеин изотиоцианат), с последующей инкубацией в течение 15 мин при 4-8 °C. Подробнее см. анализ проточной цитометрии на этапе 5.
- Добавьте 1 мл буфера FACS и центрифугируйте в течение 7 минут при 500 × г.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS на 1 × 108 клеток.
- Вставьте иммуномагнитную колонку для разделения клеток в сепаратор (держатель магнитной колонки) и поместите пробирку для сбора 15 мл под выходное отверстие колонки для сбора протока.
- Промойте колонку 1 мл дегазированного буфера FACS. После полоскания замените использованный тюбик объемом 15 мл на новый.
- Дайте клеточной суспензии (начиная с шага 1.2.8) пройти через колонку, пипетируя от 1 ×10 до 8 клеток в буфере по 500 μл за один раз.
заметка: Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха при перемешивании ячеек перед тем, как пропустить их через колонку.
- Каждый раз 3 раза промывайте колонку 3 мл дегазированного буфера FACS.
- Соберите данные о протоке и обозначьте эту первую элюированную фракцию как CD14-клеточную фракцию (PBMCs минус моноциты CD14+); это также называется наивной фракцией лимфоцитов><.
заметка: CD14−-клетки поддерживаются в полной культуральной среде до тех пор, пока не будут получены антиген-импульсные MoDC.
- Извлеките столбец из разделителя.
- Поместите новую стерильную пробирку объемом 15 мл под колонку для сбора сточных вод.
- Внесите пипеткой 5 мл буфера FACS в колонку и сразу же протолкните его с помощью поршня.
- Соберите данные о протоке и обозначьте эту вторую элюированную фракцию как клеточную фракцию CD14+; ее также называют наивной фракцией моноцитов.
- Добавьте полную питательную среду к собранным моноцитам CD14+ для получения 1 ×10 6 клеток/мл.
заметка: Подсчитайте количество живых клеток в элюированной клеточной фракции CD14+, чтобы оценить объем всей питательной среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
- Возьмите стерильный 24-луночный планшет и добавьте 1 мл клеточной суспензии (1 × 106 клеток/мл) в каждую лунку.
- Дифференцировка наивных моноцитов CD14+ в наивные MoDC путем добавления 3% w/v цитокинового коктейля (GM-CSF + IL-4) в общей сложности 5 дней инкубации
- Дополните каждую лунку, содержащую моноциты CD14+, 40 мкл (3% по объему) цитокинового коктейля, входящего в комплект.
- Инкубировать планшет во влажном инкубаторе с 5%CO2 и при 37 °C в течение 48 часов.
- На 2-й день перенесите половину содержимого каждой лунки (500 μл) с помощью пипетки в отдельные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 500 × г при 4 °C в течение 7 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 μл свежей полной питательной среды.
- Перенесите 500 мкл этой клеточной суспензии с шага 1.3.4 обратно в каждую предназначенную лунку так, чтобы конечный объем составил 1 мл.
- Обогатите каждую лунку 20 мкл цитокинового коктейля.
- Инкубировать культуру в течение 72 ч в увлажненном инкубаторе с 5%CO2 и при 37 °C.
- После инкубации на 5 день извлеките тарелку из инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка будет содержать 1 мл клеточной суспензии наивных MoDC. Количество MoDC будет составлять процент (~20%) от исходных моноцитов, покрытых (1 × 106/мл).
2. Генерация антиген-импульсных MoDC
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная и клинически одобренная вакцина против вируса бешенства (RV) может вызвать дифференцировку наивных MoDC в зрелые антигенпрезентирующие MoDC. Используйте 0,1% (~1 μл) от одной дозы вакцины RV для генерации антиген-импульсных MoDC. Кроме того, предпочтительно производить импульсные MoDC в той же культуральной тарелке, которая использовалась для получения наивных MoDC, поскольку перенос наивных MoDC на новую 24-луночную пластину негативно повлияет на них.
- Добавьте 1 μл/мл суспензии RV к 1 мл наивной культуры MoDC в 24-луночном планшете и инкубируйте в течение 48 часов при 5%CO2 и 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: наивные MoDC, культивируемые без стимуляции ПЖ, используются в качестве фонового контроля (и в качестве неспецифической стимуляции для совместного культивирования с лимфоцитами на следующих этапах).
- После инкубации, на 7-й день, держите 24-луночный планшет, содержащий антиген-импульсные MoDC, на льду в течение 10 минут.
- Добавьте 1 мл ледяного PBS на лунку. Тщательно перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования и переложите суспензию в пробирку объемом 15 мл.
- Промойте лунки 2 мл ледяного PBS, чтобы собрать остаточные клетки, оставшиеся в каждой лунке.
- Переложите содержимое в соответствующие пробирки и центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 7 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу (антиген-импульсные MoDCs) в полной культуральной среде и доведите объем до конечной концентрации клеток 1 × 105 клеток/мл.
заметка: Подсчитайте живые клетки, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток. Используйте импульсные MoDC с 7-го дня для системы совместного культивирования MoDC-лимфоцитов.
3. Совместное культивирование MoDC-лимфоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Система совместного культивирования MoDC-лимфоцитов in vitro определяет способность MoDC праймировать антиген-специфичные лимфоциты. Различные группы обработки клеток после 16 дней совместного культивирования включают специфические, неспецифические и контрольные. Специфическая группа определяется как лимфоциты, совместно культивируемые с импульсными ПЖ MoDC; неспецифическая группа определяется как лимфоциты, совместно культивируемые с неантиген-импульсными MoDC; а контрольная группа определяется как лимфоциты, культивируемые без MoDC.
- Добавьте полную питательную среду к элюированной наивной фракции лимфоцитов (CD14− клеткам) для достижения клеточной концентрации 2 ×10 6 клеток/мл.
Примечание: Подсчитайте живые клетки в культуре клеток CD14, которые содержались в полной культуральной среде в 24-луночном планшете с момента их сбора, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
- На 7-й день возьмите стерильный 24-луночный планшет и засейте лунки 1 мл суспензии наивных лимфоцитарных клеток (2 × 106 клеток/мл) плюс 1 мл антиген-импульсной или неантиген-импульсной суспензии MoDC (1 ×10 5 клеток/мл).
заметка: Общий объем в каждой лунке составит 2 мл с соотношением MoDCs к лимфоцитам 1:20 на лунку.
- Инкубируйте планшет в течение 48 часов при 37 °C и 5%CO2.
- Обогащение и рестимуляция культур антиген-импульсными MoDC
- После инкубации совместного культивирования MoDC-лимфоцитов, вызванной антигеном, на 9-й день добавьте в каждую лунку 20 нг/мл рекомбинантного IL-2 и продолжайте инкубацию в течение еще 120 ч (5 дней инкубации).
- На 14-й день перенесите 1 мл сокультуры в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 500 × г в течение 7 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 1 мл антиген-импульсных или неимпульсных MoDCs (1 × 105 клеток/мл). Осторожно перемешайте с помощью пипетирования и перенесите клеточные суспензии обратно в предназначенные для них лунки.
заметка: На этом этапе общий объем в каждой лунке составляет 2 мл.
- Продолжайте инкубацию при 5%CO2 и 37 °C в течение 48 часов. После инкубации на 16-й день сокультура готова к анализу с помощью проточной цитометрии, количественной ПЦР и ИФА.
заметка: На каждые 2 мл в каждой лунке совместной культуры MoDC-лимфоцитов окрашивают 1 мл ресуспендированных клеток для проточной цитометрии, 1 мл используют для экстракции РНК, а надосадочную жидкость из обоих лунок используют для ИФА.
4. Проточный цитометрический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивайте клетки соответствующими маркерами/mAb перед тем, как запускать образцы на проточном цитометре. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах (окрашивании mAb и контроле изотипа), наборе, приборе и программном обеспечении, используемых для анализа проточной цитометрии.
- Протокол окрашивания проточным цитометром
заметка: Проводите окрашивание поверхности клеток PBMC и наивных лимфоцитов и моноцитов с использованием анти-CD14 mAb (шаг 1.2.6). Для окрашивания поверхности клеток наивных MoDC используйте анти-CD86-специфичный, анти-CD40-специфичный и анти-MHC II-специфичный mAb. Для окрашивания клеточной поверхности клеток с 16-го дня совместного культивирования используйте анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD25 mAB; для внутриклеточного окрашивания используют анти-Ki-67 mAb. Кроме того, окрашивайте клетки либо отрицательным контролем изотипа mAb, либо без mAb (FMO: флуоресцентный минус один). Основное различие при окрашивании на поверхностные и внутриклеточные маркеры заключается в том, что для поверхностных маркеров клеток клетки должны быть окрашены специфическим поверхностным mAb перед окрашиванием живых/мертвых (L/D) или любыми другими процессами. Тем не менее, внутриклеточное окрашивание выполняется после L/D окрашивания и требует фиксации плюс стадии пермеабилизации для обеспечения внутриклеточного проникновения.
- Перенесите 1 мл клеточной суспензии в стерильную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки и центрифугируйте в течение 10 мин при давлении 500 ×г.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования, при обработке клеток из совместной культуры MoDC-лимфоцитов, сохраните надосадочную жидкость для анализа методом ИФА.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS и переложите ее в пробирку объемом 15 мл. Соберите остаточные клетки, используя 1 мл PBS, и соедините его с ресуспендированной гранулой.
- Добавьте 10 мл PBS в 15 мл пробирки, содержащей клетки, перемешайте с помощью пипетирования и центрифугируйте в течение 7 минут при 850 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг 4.1.3.
- Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно восстановите клеточную гранулу с остаточной суспензией (примерно 180 мкл), оставшейся после сцеживания надосадочной жидкости.
- Перенесите суспензию ячейки на 96-луночную пластину с V-образным дном и загерметизируйте лунки, чтобы избежать утечки.
- Центрифугируйте планшет при 1 400 × г в течение 5 минут. После центрифугирования переведите пластину над контейнером для отходов, чтобы опорожнить лунки от жидкости, и постучите пластиной по впитывающей бумаге, чтобы обеспечить удаление лишней жидкости.
- Добавьте 25 μл основной смеси для окрашивания поверхности на лунку и аккуратно перемешайте с помощью пипетки, после чего следует инкубация при 4 °C в течение 30 мин.<бр/>
заметка: Чтобы приготовить мастер-смесь для окрашивания поверхности для одной лунки, добавьте 2,5 мкл поверхностного mAb в 20 мкл буфера FACS.
- Добавьте 200 μL буфера FACS на лунку и центрифугируйте при 1400 × г в течение 5 минут. После центрифугирования опорожните лунки от жидкости путем декантации и постучите пластиной по абсорбирующей бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания L/D на лунку. Тщательно перемешать с помощью пипетки, после чего провести инкубацию при 4 °C в течение 15 минут в темноте.
заметка: Для одной лунки растворите 0,25 мкл L/D красителя в 100 мкл буфера FACS. Краситель L/D помогает различать живые и мертвые клетки.
- Добавьте 100 мкл буфера FACS. Накройте лунки крышкой, и центрифугируйте планшет в течение 1 400 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите пластиной по впитывающей бумаге.
- Повторите шаг 4.1.11.
- Добавьте 50 мкл фиксирующего раствора в лунку (входит в комплект) и перемешайте пипеткой перед инкубацией планшета при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут.
- Добавьте 150 μл 1x буфера для пермеабилизации-промывки (PW), входящего в комплект, и накройте лунки крышкой.
заметка: Чтобы приготовить 10 мл 1x PW буфера, разведите 1 мл 10x perm буфера в 10 мл dH2O.
- Центрифугируйте планшет при 1 400 × г в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, декантируя и постукивая пластиной по абсорбирующей бумаге.
- Добавьте 200 мкл 1x PW, а затем центрифугирование при 1 400 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите пластиной по абсорбирующей бумаге.
- Для внутриклеточного окрашивания добавьте 25 мкл мастер-смеси для внутриклеточного окрашивания (античеловеческий Ki-67 mAb) в лунку. Хорошо перемешайте и выдержите тарелку в течение 30 минут при температуре 4 °C или на льду в темноте.
заметка: Чтобы приготовить мастер-смесь для внутриклеточного окрашивания для одной лунки, добавьте 1 мкл Ki-67 mAb в 24 мкл 1x PW. Маркер внутриклеточного окрашивания используется только при обработке клеток с 16-го дня совместной культивирования. Внутриклеточное окрашивание не проводится при обработке PBMC, наивных лимфоцитов, моноцитов и наивных MoDC.
- После инкубации добавьте 200 мкл 1x PW в каждую лунку. Смешайте с помощью пипетки и центрифуги по 1 400 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите пластиной по впитывающей бумаге.
- Добавьте 200 мкл буфера FACS, а затем центрифугирование при 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите пластиной по абсорбирующей бумаге.
- Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 200 мкл буфера FACS и перенесите содержимое каждой лунки в отдельные трубки стерильного проточного цитометра. Используйте 300 мкл буфера FACS на лунку для сбора остаточных клеток. Теперь клетки готовы к анализу проточной цитометрии.
- Прогон образца на проточном цитометре
заметка: Образцы обгоняли на проточном цитометре (с использованием лазеров с длиной волны 488 нм, 638 нм и 405 нм) в соответствии с инструкцией производителя. Обратитесь к руководству для получения подробной информации, устранения неполадок и настройки протокола.
- Выполняйте рутинные процедуры очистки до и после считывания образцов.
заметка: Не пропускайте позицию во время загрузки трубок в инструмент.
- Для цикла очистки используйте в общей сложности четыре пробирки, первая из которых содержит реагент для очистки потока, а остальные три пробирки содержат dH2O; каждая пробирка будет содержать 3 мл. Во время очистки необходимо получать данные со средним расходом в течение примерно 1 минуты, регистрируя 100 000 событий на трубку при напряжении 330 В для прямого рассеяния (FSC) против 265 В при боковом рассеянии (SSC).
заметка: Во время уборки не следует сообщать о мусоре или событиях с ячейками; Если это произошло, повторите этап очистки. Перед получением данных убедитесь, что все образцы находятся в однородной суспензии, поскольку это обеспечивает точное считывание.
- Чтобы подключить цитометр и включить его, нажмите кнопку «Приложение», расположенную в левом углу строки заголовка. В выпадающем меню приложения выберите опцию Цитометрия и нажмите на опцию Power On.
заметка: В раскрывающемся меню приложения опция «Открыть» позволяет пользователям просматривать предварительно запрограммированные анализы, а опция «Новый протокол» позволяет пользователям создавать новые протоколы.
- Первоначально загрузите отрицательный контрольный образец в многопробирочный держатель. Выберите «Новый протокол» и просмотрите рабочий список в левой части рабочего пространства/экрана.
- В рабочем списке определите положение образца в держателе для нескольких пробирок, а также дайте имя образцу и протокол для идентификации.
- На аппаратной панели, расположенной в левой части рабочего пространства, настройте и выберите несколько параметров, таких как детекторы (FSC, SSC и 10 диапазонов флуоресценции), напряжения (В) и коэффициенты усиления фотоумножителей, а также площадь-высота-ширина (AHW) сигнала.
заметка: В зависимости от эксперимента и используемого прибора были выбраны следующие настройки детекторов: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- На панели управления захватом приборов, расположенной под строкой заголовка, отрегулируйте параметры расхода (средний), времени (5 минут) и событий (см. шаг 5.2.8), которые необходимо обнаружить. Нажмите на опцию Acquisition Single, чтобы разрешить инструменту рисовать/запускать выборку и отображать предварительный просмотр обнаруженных событий в режиме реального времени.
- В режиме предварительного просмотра в реальном времени отрегулируйте порог флуоресценции (напряжение и усиление) и размер ячейки, чтобы в конечном итоге нарисовать вентили вокруг желаемой популяции клеток, исключив при этом любой клеточный мусор.
заметка: FSC помогает различать клетки на основе размера, что позволяет пользователям дифференцировать клетки иммунной системы, такие как моноциты и лимфоциты; Моноциты крупнее и демонстрируют более высокую интенсивность FSC по сравнению с лимфоцитами.
- Получите в общей сложности около 5 000 активных MoDC, 50 000 живых лимфоцитов и 50 000 живых моноцитарных событий.
- После того, как все параметры будут скорректированы по отношению к отрицательному контрольному образцу, нажмите «Стоп» и сохраните протокол.
- Теперь загрузите все образцы в многопробирочный загрузчик. Определите каждый образец в рабочем списке и примените параметры, скорректированные по отношению к отрицательному контролю, ко всем образцам в эксперименте. Нажмите на опцию «Получить», чтобы разрешить последовательный запуск всех образцов в эксперименте.
- После того, как данные из всех образцов будут собраны, сохраните их и преобразуйте в пригодные для чтения данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных, которое позволяет создавать последовательные бипараметрические и монопараметрические гистограммы.
