Анализ нарушения гемоцитов для оценки повторной адгезии гемоцитов к кроветворным карманам

Аннотация

Источник: Petraki, S. et al., Анализ популяций клеток крови личинки Drosophila melanogaster. J. vis. exp. (2015)

В этом видео показан анализ нарушения гемоцитов, оценивающий повторную адгезию гемоцитов в гемопоэтических карманах личинок Drosophila . Механическое воздействие высвобождает резидентные гемоциты, повышая количество циркулирующих гемоцитов. После выздоровления подтверждается повторное присоединение резидентных гемоцитов, что иллюстрирует обратимость.

Протокол

1. Кровотечение/соскоб гемоцитов

1. Подготовка слайдов:
   1. Вариант 1 для микроскопов без функции сканирования плитки: Для каждой личинки, подлежащей анализу, подготовить одно предметное стекло с примерно 5 лунками Пап-ручки по квадратам 2 мм каждая, соответствующими зоне обзора поля микроскопа; добавьте примерно 5 - 10 мл среды S2 в каждую (Рисунок 1A). Храните предметные стекла во влажной камере, чтобы предотвратить пересыхание лунок.
   2. Вариант 2 для микроскопов с функцией сканирования плитки: Для каждой личинки, подлежащей анализу, подготовьте одно предметное стекло с 3-4 лунками Пап-ручки размером ~3 - 4 мм каждая; добавьте примерно 15 - 20 μл среды S2 в каждую лунку (Рисунок 1B). Храните предметные стекла во влажной камере, чтобы предотвратить пересыхание лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанное рекомендуемое количество лунок достаточно для суммарного содержания до 3,000 гемоцитов на личинку (поздние личинки 2^nd, ~2,5 - 3 мм длиной, трансген мечет большинство личиночных клеток крови). При оценке большего количества клеток крови может потребоваться больше лунок, чтобы избежать переполненности.
2. Сбор личинок:
   1. Налейте воду в флакон с личинками и смойте личинки в чашку Петри или зачерпните немного корма, содержащего личинок, в чашку Петри и разбавьте водой с помощью бутылки-распылителя.
   2. Аккуратно вытащите личинок из чашки Петри с помощью кисти и поместите их в воду в полой чашке или на предметной горке на холодном блоке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки могут храниться ограниченное время в воде или на холодном блоке; Используйте образцы в течение 45 минут или меньше, чтобы избежать гибели личинок или нежелательного воздействия на гемоциты.
3. Вскрытие:
   1. Отбирают личинок под флуоресцентным микроскопом на холодном металлическом блоке. При желании измерьте размеры и изобразите личинок.
   2. Выделение циркулирующих гемоцитов («Кровотечение»):
      1. После того, как личинки будут выбраны, поместите одну личинку в первую лунку Пап-ручки (Рисунок 1C, 2A).
      2. С помощью 2 чистых игл или препарирующих ножниц и щипцов сделайте разрез как на заднем и переднем концах личинки, так и на переднем конце. Чтобы не потревожить резидентные гемоциты, лучше всего делать эти надрезы на вентральной стороне личинки. Для получения стабильных результатов делайте надрезы в одних и тех же местах для каждой личинки. Для личинок 1^st возраста достаточно 1 разреза (в вентральной передней части).
      3. Дайте личинке истекать кровью в течение нескольких секунд без какого-либо давления или физического возбуждения (Рисунок 2A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете с несколькими личинками, лучше сделать эти надрезы для каждой из них, прежде чем переходить к следующему шагу, чтобы избежать слишком долгого удержания личинок на льду, что может повлиять на целостность образцов.
      4. Аккуратно поднимите личинку с помощью игл или щипцов и опустите ее во вторую лунку, чтобы промыть оставшиеся циркулирующие гемоциты. После этого следует выделение резидентных гемоцитов.
   3. Выделение резидентных гемоцитов («Скреб»):
      1. Аккуратно переложите личинку в следующую лунку (Рисунок 2C).
      2. Определите лимфатическую железу личинки, которая обычно расположена примерно на 1/3 от переднего конца личинки и которая может флуоресцировать дорсально через стенку тела личинки. Избегайте воздействия на лимфатическую железу, высвобождая резидентные гемоциты, прижав личинку иглой как можно ближе к лимфатической железе, чтобы избежать прокола (Рисунок 2C).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время нормального развития созревание гемоцитов лимфатических желез задерживается по сравнению с личиночными гемоцитами, и флуоресцентные репортеры дифференцированных гемоцитов могут не показывать сигнал в лимфатических узлах молодых личинок. В этих случаях лимфатическим железам необходимо уделять меньше внимания, так как не ожидается контаминации дифференцированных флуоресцентно меченных личиночных гемоцитов гемоцитами лимфатических желез.
      3. Высвобождайте резидентные клетки крови в процессе рассечения путем соскабливания и/или укола. Используйте одну иглу, чтобы эффективно прижать личинку рядом с лимфатической железой (см. выше) или другими участками тела по мере необходимости. Используйте другую иглу, чтобы уколоть в скопления гемоцитов, которые видны через стенку тела личинки (Рисунок 2C, E), стремясь разделить гемоциты. Гемоциты также могут высвобождаться при соскабливании. Тем не менее, ранний разрыв эпидермиса может привести к высвобождению больших скоплений клеток крови, что может сделать автоматический подсчет более сложным.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от возраста и генотипа личинки, общее количество гемоцитов будет варьироваться. Распределите описанный выше процесс высвобождения по нескольким лункам, чтобы избежать переполнения некоторых лунок с клетками крови, что может затруднить анализ изображений отдельных клеток.
      4. Если в конечной туше осталось мало гемоцитов, подсчитайте эти гемоциты путем наблюдения через микроскоп и использования ручного счетчика (Рисунок 2E). Чтобы облегчить подсчет, поместите тушку на чистую поверхность того же предметного стекла и разложите ее как можно тоньше, чтобы уменьшить количество оптических плоскостей.
      5. После того, как вскрытие будет завершено, подождите от 5 до 10 минут, пока клетки осядут (но не обязательно прилипнут), прежде чем делать снимки лунок. Инкубируйте предметное стекло во влажной камере, чтобы избежать высыхания, и избегайте грубого обращения со предметным стеклом, которое может нарушить осевшие гемоциты.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При определении количества гемоцитов, высвобождающиеся клетки не фиксируются, и клетки должны быть визуализированы вскоре после вскрытия, предпочтительно в течение 30 минут после выпуска из личинки. В зависимости от объема среды и свойств ячеек, подавляющее большинство ячеек осядет в течение 5 - 10 мин, что должно быть подтверждено фокусировкой через оптические плоскости среды в лунке. Тем не менее, к этому времени только часть клеток крови прилипнет к поверхности предметного стекла, и этот факт необходимо учитывать при модификации этого протокола для подходов, основанных на фиксации клеток.
4. Квантификация:
   1. Сделайте снимки осевших гемоцитов под флуоресцентным микроскопом (Рисунок 2B, D, F). Затем следует количественное определение гемоцитов с помощью программного обеспечения ImageJ.
   2. Подготовьте изображение для алгоритма подсчета ячеек ImageJ:
      1. Откройте изображение скважины с помощью ImageJ: Файл → Открыть → (найдите файл и выберите).
      2. Убедитесь, что изображения являются 8-битными или 16-битными. Отрегулируйте порог для изображения, выбрав Image, затем нажмите Adjust и выберите Threshold. Обратите внимание на "Окно порога" (Рисунок 3A).
      3. Отметьте галочкой опцию "Dark Background". Выберите "Красный" и увеличьте Нижний пороговый уровень (см. черную стрелку) до тех пор, пока каждая ячейка на изображении не будет отмечена красной точкой (ячейки, которые не покрыты, будут отображаться в оттенках серого; Рисунок 3B). При увеличении Lower Threshold некоторые ячейки станут непомеченными. Это может быть индикатором того, насколько далеко следует установить Нижний порог.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда кластеры клеток не могут быть разрешены и будут подсчитаны как одно по счетчику частиц. В таких случаях количество ячеек в кластере можно оценить, изучив изображение (при необходимости увеличьте) и подсчитав вручную с помощью счетчика. В качестве альтернативы, Нижний порог может быть увеличен для разрешения кластеров ячеек; Любые непомеченные ячейки, полученные в результате этой манипуляции, могут быть подсчитаны с помощью счетчика.
   3. Проанализируйте номер ячейки с помощью ImageJ:
      1. Запустите анализатор частиц для подсчета клеток (Рисунок 3C). Выберите Analyze и нажмите Analyze Particle. При необходимости выберите "Overlay Outlines", чтобы увидеть частицы, которые подсчитывает алгоритм (Figure 3D). В качестве альтернативы можно установить ограничение на размер или площадь в пикселях единицы измерения (e., ячейки, скопление ячеек, и т.д.) для алгоритма для подсчета.
      2. Нажмите OK. Обратите внимание на окно сводки с подсчетом (Рисунок 3E).

2. Анализ на нарушение гемоцитов

1. Чтобы нарушить гемоциты, выберите личинки и поместите их в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с примерно 0,5 г стеклянных шариков (212 - 600 мкм) и добавьте 0,5 мл воды.
2. Закручивайте трубку вручную со скоростью 10 в течение 1 мин.
3. Извлеките личинок из стеклянных шариков, вылив содержимое микроцентрифужной пробирки в чашку Петри и выбрав личинки кистью.
4. Для восстановительной фазы поместите личинок в заранее подготовленные чашки Петри с небольшим количеством корма для мух. Дайте личинкам восстановить свой гемоцитарный рисунок в течение 45 минут или по желанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте все личинки, которые перестали двигаться, так как они погибли в процессе. Тем не менее, обычно мы видим небольшие повреждения после 1 минуты вихря.
5. После периода восстановления продолжайте проводить анализ кровотечения/соскапа, как описано выше в Раздел 1.

Результаты

Рисунок 1. Установка и схема анализа кровотечения/соскоба и возмущения гемоцитов. (А) Single Image Slide Setup: пять квадратов 2 мм для визуализации с 5-кратным объективом. (B) Tile Slid Setup: четыре квадрата 3 мм для визуализации кровотечения/царапин личинок ≤ 2,5 мм с помощью микроскопа для сканирования плитки. Рекомендуемые цели для визуализации - 5X или 10X. (C)...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6 см/9 см чашки Петри			По одному для каждого оцениваемого генотипа
Бутылка для брызг водой
Металлическая ложка/шпатель
Тонкая кисть			, например, "лайнер"
Тарелка со стеклянной полостью
ПАП-ручка: Super PAP PEN IM3580	Бекман Коултер
Стеклянные горки			На каждом слайде будет нарисовано 5 или более квадратов PAP PEN. Размер квадратов зависит от объектива изображения и увеличения камеры микроскопа; Например, квадраты 2 мм.
Влажная камера			Это будет использоваться для предотвращения высыхания горок и колодцев: герметичный контейнер с мокрыми бумажными полотенцами, выстилающими стенки/дно
Среда для культивирования клеток дрозофилы Шнайдера	Invitrogen
Холодный блок			Это металлический блок (он же нагревательный блок), охлажденный в ведре со льдом; предпочтительно черного цвета или другого темного, неотражающего цвета
Два шприца 1 мл с иглами (27G 1/2)	Бектон Дикинсон		Для вскрытия.
Опционально: Ножницы с хирургической пружиной (режущая кромка 2 мм)	Инструменты изобразительной науки
Стеклянные шарики, 212-600 микрон	Сигма
2 мл пробирки Eppendorf	Eppendorf		Один на каждый генотип, оценивающий
Вихревой смеситель	Научный Фишер
Трансгенные личинки дрозофилы с флуоресцентно маркированными гемоцитами. Подходящие трансгены включают: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP и -GFP (Gajewski et al., 2007) или HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)) или eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) в сочетании с UAS-GFP или другими трансгенами флуоресцентных белков.
Флуоресцентный препарирующий микроскоп	Leica		Здесь: Leica M205, опционально с камерой, программным обеспечением для обработки изображений и измерительным модулем
Инвертированный флуоресцентный микроскоп с насадкой для камеры	Leica или Keyence		С функцией сканирования плитки или без нее (например, Серия Leica DMI, серия Keyence BIOREVO BZ-9000)