Методика окрашивания пептидом-MHC-I тетрамером для анализа SIV-специфичных CD8+ Т-клеток памяти

Аннотация

Источник: Gonzalez-Nieto, L., et al. Анализ CD8⁺ + Т-клеток, специфичных для вируса иммунодефицита обезьян, у макак-резусов с помощью окрашивания тетрамером пептида-MHC-I. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует метод характеристики CD8⁺ Т-клеток памяти, специфичных для вируса иммунодефицита обезьян (SIV), с использованием тетрамеров пептид-главного комплекса гистосовместимости класса I (PMHC-I). Тетрамер pMHC-I представляет собой комплекс из четырех молекул MHC-I, связанных с SIV-специфичными пептидами и конъюгированных с флуорофором. Эти тетрамеры избирательно связываются с Т-клеточными рецепторами (TCR) на SIV-специфичных CD8⁺ Т-клетках, облегчая характеристику этих клеток.

Протокол

1. Лечение PKI

ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательно, но рекомендуется для тетрамеров Mamu-B*017:01.

1. Ресуспендируйте PBMC в среде R10 в концентрации 1,6 х 10⁷ клеток/мл.
2. Добавьте 50 мкл этой клеточной суспензии в соответствующие пробирки проточной цитометрии. Добавьте в каждую пробирку 50 мкл 100 нМ раствора PKI.
3. Закрутите каждую трубку. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут. К концу этого этапа каждая пробирка должна содержать 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 8,0 x 10⁵ PBMC и 50 нМ PKI.
4. Перейдите к этапу окрашивания тетрамером pMHC-I.

2. Окрашивание тетрамерами pMHC-I, меченными флуорохромом

1. Перед приготовлением мастер-смеси для тетрамеров pMHC-I пробирки с тетрамером pMHC-I центрифугируют при давлении 20 000 x g в течение не менее 15 минут при 4 °C. Целью этого этапа является гранулирование белковых агрегатов в растворе тетрамера pMHC-I, которые могут увеличить фоновое окрашивание. После завершения этапа центрифугирования избегайте пипетирования со дна пробирки, где будут накапливаться белковые агрегаты.
2. Приготовьте достаточное количество мастер-смеси для тетрамера pMHC-I, чтобы окрасить все экспериментальные пробирки. Приготовьте избыток 15% от общего объема этой мастер-смеси с учетом ошибок пипетирования.
3. Разбавьте тетрамеры pMHC-I в буфере для окрашивания (например, Brilliant Stain Buffer) так, чтобы в каждый тест добавлялось 25 мкл мастер-смеси тетрамера pMHC-I.
   1. Пометьте PBMC двумя тетрамерами pMHC-I на тест, один из которых конъюгирован с аллофикоцианином (APC), а другой с Brilliant Violet (BV) 421.
4. Добавьте 8,0 x 10⁵ PBMC в соответствующие пробирки для проточной цитометрии в конечном объеме 100 мкл. Если клетки были подвергнуты описанной выше обработке PKI, на этом этапе они уже должны быть ресуспендированы в 100 μл.
5. Добавьте 25 мкл мастер-смеси тетрамера pMHC-I в соответствующие пробирки проточной цитометрии. К концу этого этапа конечный объем в каждой пробирке должен составлять 125 мкл.
6. Сделайте вихревую обработку каждой трубки для того, чтобы гомогенизировать клеточную суспензию.
7. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 45 мин. Приготовьте коктейль моноклональных антител (mAb), окрашивающий поверхность, во время этой 45-минутной инкубации.

3. Окрашивание поверхностей

1. Приготовьте достаточное количество мастер-смеси mAb, чтобы окрасить все экспериментальные пробирки. Приготовьте избыток 15% от общего объема этой мастер-смеси с учетом ошибок пипетирования.
2. Отрегулируйте объем мастер-смеси с буфером для окрашивания так, чтобы на тест добавлялось 50 μл.
3. Для надлежащего исключения не-CD8⁺ Т-клеток и разграничения подмножеств памяти используйте титруемые количества mAb, направленные против следующих молекул в мастер-смеси для окрашивания поверхности.
   заметка: Флуорохромы, конъюгированные с каждым мАТ, приведены в качестве эталона: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 и CCR7 FITC. Обратите внимание, что mAb против CD14, CD16 и CD20 конъюгированы с одним и тем же флуорохромом (т.е. BV 510), поскольку они будут включены в вентиль «дампа».
4. Включите в состав мастер-смеси для окрашивания поверхности фиксируемый краситель для распознавания мертвых клеток [т.е. амино-реактивный краситель (ARD)]. Убедитесь, что реагент ARD сопряжен с флуорохромом со спектром излучения, аналогичным тем, которые используются в затворе «дампа». В этом случае используйте ARD Aqua.
5. Добавьте 50 мкл окрашивающей мастер-смеси, описанной в 3.1-3.4, в соответствующие пробирки проточной цитометрии. К концу этого этапа конечный объем в каждой пробирке должен составлять 175 мкл.
6. Закрутите каждую трубку. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 25 минут.
7. Промывка камер промывочным буфером (фосфатно-солевой раствор (PBS), содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,45 г/л NaN3).
   осторожность: Азид натрия (NaN₃) является токсичным веществом. Воздействие даже незначительных количеств может вызвать симптомы. Обращайтесь с этим веществом в соответствии с рекомендациями, указанными Отделом гигиены и безопасности окружающей среды (EHS) в учреждении, где проводятся эти эксперименты.
8. Центрифужные пробирки при плотности 510 х г в течение 5 мин. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в отдельный контейнер для отходов. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулы.
   осторожность: Не сцеживайте надосадочную жидкость из буфера промывки в резервуары, содержащие отбеливатель, так как он может вступить в реакцию с азидом натрия, присутствующим в буфере для промывки, и привести к образованию токсичного газа. Обратитесь в офис EHS в учреждении, где проводятся эти эксперименты, чтобы получить рекомендации по утилизации азида натрия.
9. После декантации переведите клетки в оставшуюся жидкость, оставшуюся в каждой пробирке.

4. Фиксация клеток

1. Добавьте 250 μл 2% раствора параформальдегида (PFA) во все пробирки для фиксации клеток.
   ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным веществом. Воздействие даже незначительных количеств может вызвать симптомы. Обращайтесь с этим веществом в соответствии с рекомендациями, указанными отделом EHS в учреждении, где проводятся эти эксперименты.
   1. Поскольку 2% раствор PFA должен быть изотоническим для клеток, используйте PBS для приготовления этого раствора. Ста миллилитров 2% раствора PFA достаточно для проведения многократных экспериментов. Тщательно проделайте вихревую обработку всех пробирок сразу после добавления 2% PFA с целью предотвращения образования клеточных агрегатов.
2. Выдерживать в темноте при температуре 4 °C в течение 20 минут.
3. Промойте ячейки, повторяя шаги 3.7-3.9. После завершения этого этапа клетки можно хранить в темноте при температуре 4 °C в течение 24-48 часов. Прежде чем приступить к фазе пермеабилизации, тщательно проведите вихревые трубки.

5. Проникновение клеток

1. Добавьте 500 μл буфера для пермеабилизации. Вихревые все трубки.
2. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут.
3. Промойте ячейки, повторяя шаги 3.7-3.9.

6. Внутриклеточное окрашивание

1. Приготовьте достаточное количество мастер-смеси mAb, чтобы окрасить все экспериментальные пробирки.
2. Отрегулируйте объем с помощью PBS или буфера для окрашивания таким образом, чтобы на один тест добавлялось 50 μл внутриклеточной мастер-смеси mAb.
3. Приготовьте мастер-смесь mAb, описанную в 6.1 и 6.2, используя титруемые количества mAb, направленные против CD3 и гранзима B (Gzm B).
   заметка: Взаимодействие TCR тетрамеров pMHC-I может привести к интернализации CD3, что может препятствовать обнаружению тетрамеров + CD3⁺ CD8⁺ Т-клеток, если анти-CD3 mAb добавить в основную смесь для окрашивания поверхности. Чтобы этого избежать, добавляйте анти-CD3 mAb на этой стадии, то есть после того, как клетки проникнуты. Флуорохромы, конъюгированные с каждым mAb, перечислены в качестве эталонных: CD3 PerCP Cy5.5 и Gzm B PE.
4. Добавьте 50 μл коктейля mAb в соответствующие пробирки. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.
5. Промойте ячейки, повторяя шаги 3.7-3.9. Пробирки готовы к получению в проточном цитометре.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дазатиниб	Аксон медхим	Аксон 1392	Необходимо повторно суспендировать в ДМСО и немедленно хранить при температуре -20°C
RPMI с глутамаксом	gibco/ Life Technologies	No 61870-036	Необходимо хранить при температуре 4 °C
Термоинактивированный FBS	gibco/ Life Technologies	10082-147	Необходимо хранить при температуре 4 °C
Пенициллин-стрептомицинп-амфотерицин В	Лонза	17-745Э	Необходимо хранить при температуре 4 °C
ДМСО, безводный	Технологии Life	Д12345	Хранить при комнатной температуре.
Полипропиленовые пробирки с круглым дном объемом 5 мл	ВВР	60819-728
Флуорохром-конъюгированные тетрамеры pMHC-I	NIH Tetramer Core или MBL, Inc.		Необходимо хранить и поддерживать при температуре 4 °C. Центрифугу при температуре 20 000 x g в течение 15 минут перед использованием. Не замораживайте.
Флуорохром-конъюгированные мАТ	Различные компании		Необходимо хранить и поддерживать при температуре 4 °C. Не замораживайте.
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания от мертвых клеток Aqua Dead Cell	Технологии Life	л34957	Необходимо хранить при температуре -20 °C. Перед использованием каждую аликвоту повторно суспендировать в 50 мкл ДМСО.
Блестящий буфер для морилки	BD Biosciences	563794	Необходимо хранить при температуре 4 °C
Фосфатно-солевой буфер	ВВР	97064-158	Хранить при комнатной температуре
Альбумин бычий	ВВР	700011-230	Необходимо хранить при температуре 4 °C
Азид натрия	ВВР	97064-646	Хранить при комнатной температуре. Токсичное вещество. Не смешивайте с отбеливателем.
отбеливать	ВВР	89501-620	Коррозионное химическое вещество, нельзя смешивать с азидом натрия. Обращайтесь бережно
Параформальдегид	Науки электронной микроскопии	15714-С	Легковоспламеняющийся, коррозионный и токсичный реагент. Обращайтесь бережно
Полисорбат 20 (Твин-20)	Альфа Аэсар	Л15029	Хранить при комнатной температуре
Решение для пермеабилизации 2	BD Biosciences	340973	Токсичный и коррозионный реагент. Обращайтесь бережно
Трубки Sarsdet 1,5 мл с завинчивающейся крышкой	ВВР	72.692.005
2,0 мл ДНК/РНК Пробирки с низким связыванием	Эппендорф	22431048	Использование стерильных микропробирок предпочтительно
Вихревой смеситель
Шкаф биобезопасности
Система очистки воды Milli Q Intergral	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Можно использовать воду класса молекулярной биологии от любого поставщика
Микроцентрифуга
центрифуга
Холодильник 4 °C
BD LSR II	BD Biosciences		Проточный цитометр должен содержать лазеры и фильтры, совместимые с используемой окрашивающей панелью.
Деионизированная вода
Алюминиевая фольга	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
инкубатор			Должен поддерживать внутреннюю температуру 37 °C
Программное обеспечение FACS Diva	BD Biosciences
Программное обеспечение Flowjo версии 9.6	Флоуджо		Используется для анализа файлов FCS, сгенерированных программным обеспечением FACS Diva
Наконечники Micropippette