Анализ на основе ламинарного потока для изучения взаимодействий между лейкоцитами и эндотелиальными клетками

Аннотация

Источник: Vajen, T., et al. Анализы на основе ламинарного потока для изучения рекрутирования лейкоцитов на культивируемых сосудистых клетках и адгезивных тромбоцитах. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ на основе ламинарного потока для характеристики взаимодействия лейкоцитов и клеточных партнеров, таких как эндотелиальные клетки. Этот метод обеспечивает динамическое понимание адгезии, мертвой гезии и трансмиграции лейкоцитов при перфузии над интактным и сливающимся слоем сосудистых клеток.

Протокол

1. Флуоресцентное мечение и перфузия лейкоцитов (PMN или THP-1 для человека и RAW264.7 или первичные моноциты мыши для анализа мышиного потока)

1. Флуоресцентная маркировка
   1. Пометьте лейкоциты (1 x 10⁶/мл) с помощью зеленого флуоресцентного красителя для нуклеиновых кислот (1 мкМ). Инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 °C.
   2. Промойте клетки PBS центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут и суспензируйте клетки до концентрации 0,5 x 10⁶ клеток/мл (5 мл на одно испытание, в зависимости от скорости потока) в буфере для анализа.
2. Подготовка к анализу в проточной камере ....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инвертированный флуоресцентный микроскоп, например, EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Насос, например, модель: 210-CE	Мировые прецизионные приборы	78-9210Вт
Falcon 35 мм TC-обработанная чашка для клеточных культур в стиле EasyGrip	CORNING	353001
Шприц 50 мл	Бектон Дикинсон	300137
Силиконовые трубки	ВВР	228-0700 (Английский
Соединитель Elbow Luer с наружной резьбой	Там же	10802
Женская муфта Luer Lock	Там же	No 10823
Проточная камера	Университетская клиника Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена	Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitroUntersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005 год.
Коллаген I типа, крысиный хвост	Life Technologies Europe bv	A1048301
Рекомбинантный человеческий TNF-α	Пепротех	300-01А
Активатор тромбиновых рецепторов для пептида 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	No 24191
SYTO 13 зеленый флуоресцентный краситель для нуклеиновых кислот	Life Technologies Europe bv	С7575
Дигидрат хлорида кальция	Мерк	102382
Гексагидрат хлорида магния	Сигма-Олдрич Хеми	М2670
Моноциты/макрофаги мыши RAW264.7	АТКС	ТИБ-71
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы	Gibco	11965092

)