$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Флуоресцентное мечение и перфузия лейкоцитов (PMN или THP-1 для человека и RAW264.7 или первичные моноциты мыши для анализа мышиного потока)
- Флуоресцентная маркировка
- Пометьте лейкоциты (1 x 106/мл) с помощью зеленого флуоресцентного красителя для нуклеиновых кислот (1 мкМ). Инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 °C.
- Промойте клетки PBS центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут и суспензируйте клетки до концентрации 0,5 x 106 клеток/мл (5 мл на одно испытание, в зависимости от скорости потока) в буфере для анализа.
- Подготовка к анализу в проточной камере
- Для адгезии лейкоцитов на клеточном монослое выбросьте среду для клеточной культуры из чашки и соберите ее в проточную камеру. Подсоедините трубку к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитах подсоедините микропредметное стекло к шприцу. Предварительно разогрейте водяную баню до 37 °C.
- Возьмите перфузионный шприц (50 мл), установите шприц на держатель шприца и установите насос в режим вывода. Установите объем насоса на 0 мл, а диаметр для шприца объемом 50 мл на 26,70 мм.
- Подсоедините локтевый соединитель Люэра к одному концу трубки. Поместите муфту с люэровским замком на шприц и подсоедините трубку с локтевым люэровским соединителем к муфте люэровского замка. Подсоедините свободный конец трубки к проточной камере.
- Перфузия и адгезия лейкоцитов
- Для адгезии лейкоцитов на клеточном монослое выбросьте среду для клеточной культуры из чашки и соберите ее в проточную камеру. Подсоедините трубку к шприцу. Для адгезии лейкоцитов на иммобилизованных тромбоцитах подсоедините микропредметное стекло к шприцу.
- Для перфузии лейкоцитов и адгезии к сосудистому или тромбоцитарному монослою поместите вторую трубку в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер для анализа, и заполните трубку пипеткой объемом 1 мл, затем сожмите трубку и подключите ее к проточной камере.
- Перед перфузией лейкоцитов добавьте 3 мМ CaCl2 и 2 мМ MgCl2 в клеточную суспензию и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C.
- Перфузный буфер для анализа перед перфузией клеток для удаления возможного воздуха из камеры и трубки.
- Закройте концы пробирок, плотно сжав их и переключив трубку с буфера для анализа на клеточную суспензию, предотвращая попадание пузырьков воздуха. Перфузируйте ячейки с соответствующей скоростью потока/напряжением сдвига до тех пор, пока не поступят первые ячейки.
- Перфузируйте ячейки с соответствующей скоростью потока/напряжением сдвига в течение 2 минут и сделайте не менее 6 снимков катящихся и адгезивных клеток в течение 2–6 минут с помощью инвертированного фазового контраста/флуоресцентного микроскопа (например, EVOS-FL) с использованием 100-кратного увеличения, подключенного к цифровой ПЗС- или КМОП-камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока/напряжение сдвига зависят от размеров проточной камеры и вязкости перфузата. Для используемой здесь перфузионной камеры (см. Таблицу материалов):
τ=η*97.1*Φ
τ: напряжение сдвига (1 dyn/см2)
η: вязкость (0,015 дин*с/см2)
Φ: Расход (0,67 мл/мин)
- Расклеивание лейкоцитов
- Для удаления адгезии переключите трубку с суспензии клеток на буфер для анализа, сжимая трубку, предотвращая попадание пузырьков воздуха.
- Отделите ячейки перфузией с помощью буфера для анализа с соответствующей скоростью потока/напряжением сдвига (см. примечание 3.3.7).
- Трансмиграция лейкоцитов
- Для трансмиграции лейкоцитов перфузируйте лейкоциты (шаг 3) до тех пор, пока не прилипнет достаточное количество лейкоцитов (~50 клеток/поле просмотра).
- Замените лейкоцитарную суспензию на буфер для анализа.
- Записывайте трансмиграционные клетки с помощью интервальной съемки каждые 10–15 с в течение 30–60 мин при 37 °C.