$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Изготовление наноструктур
- В качестве подложек для нанопроизводства выбирайте стеклянные покровные стекла диаметром 25 мм и толщиной около 170 μм (No 1,5).
- Погрузите покровные стекла в раствор пираньи (соотношение серной кислоты и перекиси водорода 3:1) не менее чем на 6 часов. Промойте пропитанный пираньей покровный стакан обильным количеством сверхчистой деионизированной дистиллированной воды (DDW) с концентрацией 18,2 МОм.
осторожность: Кислота пираньи бурно реагирует с органическими материалами, и с ней нужно обращаться с особой осторожностью.
- Наносите тонкую пленку хрома с длиной волны 10 нм на покровные стекла с помощью электронно-лучевого испарения, чтобы избежать эффектов заряда во время моделирования и визуализации наноструктур.
- Открутите первый слой двухслойного резиста, состоящего из сополимера этиллактата метилметакрилата (MMA_EL6) со скоростью 2000 об/мин в течение 45 сек, а затем запекайте при 150 °C. Отжмите второй слой полиметилметакрилата (950PMMA_A2) со скоростью 3000 об/мин в течение 45 сек, затем запекайте при 180 °C.
- Моделирование двухслойного резиста с помощью электронно-лучевой литографии (ЭБЛ) при напряжении 25 кВ с площадной дозой 300 мкС/см2. Проявить в изопропиловом спирте (IPA)/метилизобутилкетоне (MIBK): 2/1 и промыть в IPA.
- Нанесите пленку Ti (5 нм) / Au (80 нм) на подложку с помощью электронно-лучевого испарителя.
- После осаждения золота снимите сополимерный бислой сопротивления, замочив подложку в ацетоне на 4 часа.
- Осмотрите подложку с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) для подтверждения формы и размера наноструктуры, удалите оставшийся хром с подложки с помощью влажного травления с помощью травителя CR-7 в течение 60 секунд при RT, а затем промойте в DDW.
- Спроектируйте расстояние между центрами матриц 33 мкм, чтобы оставить место для визуализации клеток между массивами. Смоделируйте наноструктуры в формате 20 x 20 для каждой матрицы с шагом 300 нм с помощью электронно-лучевого пишущего устройства. Каждый чип содержит 300 массивов с типичным размером наноструктуры 80±2,5 нм в высоту и 70±2,5 нм в диаметре.
- Осмотрите подмножество массивов с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) для проверки размера и однородности.
- Прикрепите опорное кольцо, обычно силиконовое, к задней части покровного стекла с помощью эпоксидной смолы, отверждаемой ультрафиолетовым излучением.
2. Очистка стружки и нанесение самособирающегося монослоя
- Для очистки и регенерации микросхем плазменная зола мощностью 40 Вт в 300 мТорр смесь 5% водорода и 95% аргона в течение 45 сек после очистки камеры в течение 5 мин в тех же условиях.
- Функционализируйте наноструктуры золота сразу после плазменного озоления путем погружения чипа в двухкомпонентный раствор этанолиттиола, состоящий из соотношения SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) в соотношении 3:1 и компонента с аминной или карбоксильной функциональной группой, а именно SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) или SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Оставьте микросхему в тиоловом растворе O/N для образования самоорганизующегося монослоя (SAM).
- Промойте чипсу этанолом и обсушите его газообразным азотом.
- При необходимости храните функционализированный чип до 2 недель при температуре 4 °C.
- Когда компонент SPN или SPC готов к использованию, реакцию с лигандом с использованием химического состава, в зависимости от выбранного лиганда (см. ниже).
заметка: Чипы могут быть регенерированы и повторно функционализированы десятки раз. Данный чип может использоваться в течение периодов от 6 месяцев до более года. Спектры, измеренные на данной решетке, надежно воспроизводятся после повторных регенераций методом плазменного озоления с последующей биофункционализацией.
3. Функционализация поверхности и кинетическая характеристика
Примечание: Используйте функционализированный чип в коммерческом инструменте SPR для характеристики констант кинетической скорости между лигандом и анализируемым веществом, а также для изучения устойчивости SAM к неспецифическому связыванию. Существует широкий диапазон скоростей потока и микрофлюидных конструкций, которые обеспечивают эффективную функционализацию поверхности. Поскольку у нас есть коммерчески доступный SPR, мы стандартизировали его в соответствии с рекомендуемыми расходами. Следует отметить, что эти скорости расхода характерны для всех приборов SPR и поэтому не являются ограничивающими. Инструмент SPR не является необходимым, поскольку вся функционализация может быть выполнена непосредственно на чипе локализованной поверхностной плазмонной резонансной томографии (LSPR), но он снизил нашу рабочую нагрузку, потому что это мультиплексированный инструмент, в то время как наша микрофлюидная установка LSPR — нет.
- Функционализация коммерческого чипа «голого золота» с помощью SAM, как описано в разделе 2.
- При использовании SAM на основе SPC активируйте карбоксильную группу смесью 133 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и 33 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS) в соотношении 1:1 в течение 10 мин.
- Конъюгируйте активированную карбоксильную группу с представляющим интерес антителом/лигандом в течение 300 сек, используя скорость потока 30 мкл/мин. Обычно готовьте лиганды в фосфатном буфере pH 6, но это может варьироваться в зависимости от молекулы.
- После конъюгации лиганда введите 0,1 М этаноламин в фосфатно-солевой буфер (PBS) в качестве стадии деактивации в течение 300 секунд со скоростью 30 мкл/мин. Этаноламин помогает свести к минимуму неспецифическое связывание.
- Введите интересующий аналит со скоростью потока 100 мкл/мин с использованием диапазона концентраций и рассчитайте константы кинетической скорости с помощью программного обеспечения для кинетического анализа.
- Если неспецифическое связывание проблематично, увеличьте отношение SPO к SPC или SPN.
4. Общие настройки LSPR
- Настройки микроскопа:
- Используйте галогенную лампу мощностью 100 Вт, чтобы Келер подсветил образец. Используйте фильтр длинных частот (обычно 593 нм) на световом пути, чтобы устранить длины волн, которые не влияют на резонансный сдвиг (рис. 1).
- Для сбора данных LSPRi используйте инвертированный микроскоп с 40-кратным масляным иммерсионным объективом (1,4 NA) и 16-битную ПЗС-камеру с термоэлектрическим охлаждением.
- Поместите светоделитель в выходной порт микроскопа для одновременного получения изображений и спектров.
- Установите температурный столик микроскопа на 37 °C и установите равновесие в течение 4 часов.
- Установите на микроскоп дополнительный инкубационный узел для регулирования концентрации и влажностиCO2 на уровне 5% и 95% соответственно.
- Подготовка и монтаж стружки:
- Функционализируйте чип LSPR, как описано в разделе 2, с оптимальными соотношениями SAM между двумя и 8 компонентами, определенными в экспериментах SPR.
- Загрузите чип в специально изготовленный микрофлюидный держатель следующим образом. Поместите чип на алюминиевую нижнюю часть. Проложите чип между этой нижней частью и силиконовой прокладкой и прозрачной пластиковой верхней частью. С помощью 4 винтов зажимаем узел.
- Для типичного применения тиола на основе SPC нанесите 300 мкл смесь 1:1 из 133 мМ EDC и 33 мМ NHS в DDW для активации карбоксильных групп тиолового компонента SPC.
- Подождите 10 минут и вручную промойте поверхность 10 мМ PBS.
- Конъюгируйте активированную карбоксильную группу с лигандом (обычно антителом или фрагментом антитела), представляющим интерес, путем нанесения покрытия на 300 мкл раствора лиганда.
- Подождите 30 минут и вручную промойте 10 мМ PBS.
- Капните 300 мкл 0,1 М этаноламина, содержащегося в PBS на чипе, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание. Подождите 10 минут.
- Промойте этаноламин PBS, содержащим 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
- Поместите кусочек кварца над чипом, чтобы уменьшить колебания данных, связанные с изменением мениска.
- Держите чип влажным с помощью буфера PBS-T20 во время установки его на микроскоп.
- Плотно поместите узел чипа LSPR в держатель образца с подогревом и прикрепите микрофлюидную трубку.
- Прикрепите трубку микрофлюидики к сборке и буферу потока (или к бессывороточной среде для клеточных исследований) до тех пор, пока не будет достигнуто устойчивое состояние.
- Дайте сборке и микроскопу сбалансироваться не менее 2 часов.
- Выровняйте микросхему с помощью джойстика так, чтобы центральная матрица была совмещена с оптоволоконным кабелем для спектроскопии. Спектроскопические данные собираются с помощью спектрометра и программного обеспечения для спектрального анализа.
- Удерживайте массивы в фокусе на протяжении всего эксперимента с помощью программного автофокуса, Zeiss Definite Focus или аналогичного устройства автофокусировки.
5. LSPR-визуализация анти-c-myc секреции из гибридомных клеток 9E10
Примечание: Гибридомная клеточная линия, используемая для этого исследования, экспрессирует антитела против c-myc конститутивно и, следовательно, не требует химического триггера
- Функционализируйте наноструктуры пептидом c-myc. Это имеет значение KD 1,77 нМ для антител против c-myc, секретируемых клонированными клетками гибридомы 9E10.
- Культивируйте гибридомные клетки в полной питательной среде с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиком в колбе T75 при 37 °C при 5%CO2. Поддерживайте плотность клеток 4 ×105 клеток/мл.
- Для исследования клеточной секреции гранулированные клетки из колбы Т75 методом центрифугирования дважды промывают бессывороточной средой (SFM) RPMI-1640 для удаления секретируемых антител и доведения плотности клеток до 4 ×106 клеток/мл.
- Соберите клетки и проверьте их жизнеспособность, прежде чем вводить их в чипы LSPR.
- Введите 50 мкл раствора ячейки вручную в чипы LSPR с помощью микропипетки. Через несколько минут от 25 до 50 ячеек прилипают к поверхности чипов LSPR.
- Оставшиеся клетки в растворе смойте свежим SFM с помощью микрофлюидной перфузионной системы.
- Выберите матрицы LSPR для визуализации, которые расположены близко, в пределах 10 мкм, но не перекрываются с ячейками.
- Чтобы гарантировать, что сигнал специфичен для секретируемых антител против c-myc, вводят среду для культивирования клеток с присутствующими антителами и без них, а также с антителами, но с сайтами их связывания, заблокированными присутствием насыщающей концентрации пептида c-myc в растворе.
- Калибруйте датчики в конце каждого прогона насыщающим раствором антител против c-myc (250 нМ). Это помогает нормализовать отклик датчиков и определить фракционную заполняемость на основе профиля биофункционализации каждого прогона.
- Откорректируйте смещение в направлениях X и Y с помощью программного обеспечения для выравнивания изображений.
