$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Титрование вируса
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества вирусов и количества дубликатов, планшет для лунок может быть настроен со следующими гибкими возможностями: (1) Разведение вируса может быть организовано либо по строкам, либо по столбцам (Рисунок 1). Каждый вирус должен занимать отдельную строку/столбец. (2) Шаг разведения вируса является гибким, но он должен начинаться с самой высокой концентрации вируса в верхнем левом углу. (3) Количество дубликатов не ограничено.
- Аликвотируйте достаточное количество клеток MDCK или MDCK-SIAT8 в 96-луночные планшеты (200 мкл/лунка). Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 или 3 дней до достижения слияния. Пропагандируют клетки в DMEM с добавлением 10% инактивированной при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Инкубировать клетки SIAT при 37 °C с 5%CO2 и 1 мг/мл сульфата G418.
заметка: Коэффициент разведения зависит от опыта и используемой клеточной линии. Клеточный монослой должен быть конфлюентным (т.е. без клеточной стенки или видимого контура для клеток MDCK и плотно упакованным расположением для клеток MDCK-SIAT1) на момент инокуляции вируса. Примеры разведений на основе субкультуры конфлюентных колб клеток MDCK или MDCK-SIAT1 приведены в таблице 1.
- Промойте клетки 3 раза 200 мкл вирусной питательной среды (VGM) на лунку. Простерилизуйте многослойную машину для мытья тарелок с 70% EtOH в течение 30 минут, а затем промойте ее в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) или VGM перед стиркой.
- Отсадите VGM и сразу же добавьте 50 μl VGM в каждую лунку.
- Добавьте 900 μл VGM в каждую из 6 стерильных пробирок (или меньше, в зависимости от количества тестируемых вирусов и дубликатов). Нанесите пипеткой 100 мкл вируса в первую пробирку, хорошо перемешайте и последовательно разбавляйте, меняя кончики между каждым разведением. Повторите для каждого титруемого вируса.
заметка: Это даст разведения вируса от 10-1 до 10-6.
- Добавьте по 50 мкл каждого разведения вируса, начиная с максимального разведения (1 x 10-5 на рисунке 1), в дублирующие лунки (столбцы 9 и 10 на рисунке 1) 96-луночного планшета.
- Поместите планшет при температуре 37 °C на 2-3 часа, чтобы вирус мог заразить клетки><.
заметка: Инкубация продолжительностью от 2 до 3 часов необходима для того, чтобы вирусы в посевном материале успели достичь монослоя.
- Подготовьте накладку (10 мл/тарелка)<бр/>
заметка: Накладка состоит из 5 мл 2x DMEM, трипсина (конечная концентрация 2 мкг/мл), 20 мкл 1 мг/мл бульона и 5 мл целлюлозного хлопкового линта (см. Список материалов).
- Удалите инокулянт.
- Добавьте накладку (200 мкл в каждую лунку). Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C, СПОКОЙНО.
заметка: Окулировка вируса происходит примерно через 4 часа, поэтому важно, чтобы по истечении этого времени пластина не была нарушена.
- Отсасывайте накладку из лунок.
- Добавьте ледяной 4% параформальдегид в PBS A (200 μл/лунка). Поместите их при температуре 4 °C на 30 минут или при комнатной температуре на 20 минут
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS A представляет собой природный фосфатно-фосфатный солевой раствор с 10 г NaCl, 0,25 г KCl, 1,437 г Na2HPO4, 0,25 г KH2PO4 и 1 л дистиллированной воды (см. Список материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид вреден при вдыхании и может вызвать ожоги при проглатывании. Также имеются ограниченные доказательства канцерогенного эффекта, и он может вызвать сенсибилизацию после контакта с кожей.
- Отсадите параформальдегид и дважды промойте пластины PBS A (200 μл/лунка).
- Храните пластины в PBS A при температуре 4 °C для использования в будущем или выполните следующие действия.
- Добавьте буфер для пермеабилизации (100 мкл/лунка). Оставьте при комнатной температуре на 30 минут.
- Дважды вымойте тарелку PBS A (200 μл/лунка).
- Добавьте 50 мкл первого антитела, мышиного MAb против гриппа типа А (1:1000 в буфере ELISA), в лунку. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение 1 часа (или 4 °C на ночь), встряхивая.
- Промойте его 3 раза в 100 мкл промывочного буфера (0,05% Tween 80 in PBS A, v/v) на лунку. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение 5 минут между стирками. Поочередно промывайте его 3 раза без инкубации по 300 мкл на лунку.
- Добавьте 50 мкл второго антитела, конъюгата HRP козьего антимышиного IgG (H+L) HRP (1:1000 в буфере ИФА), на лунку. Выдерживают его при комнатной температуре в течение 1 часа, с встряхиванием.
- Постирайте его 3 раза, как описано в пункте 1.17.
- Добавьте субстрат (50 мкл/лунка). Инкубируйте его при комнатной температуре в течение 30 мин или до тех пор, пока не станет хорошо заметно развитие синего цвета.
- Чтобы остановить реакцию, дважды промойте планшет 200 мкл дистиллированной воды на лунку, инкубируя при комнатной температуре в течение 2-3 мин между промывками.
- Высушите тарелку на воздухе и храните в темном месте (например, заверните в алюминиевую фольгу).
2. Нейтрализация вирусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте количество планшетов, необходимых для анализа нейтрализации. Каждая пластина может вместить один вирус и несколько антисывороток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества антисывороток и количества дубликатов, луночный планшет может быть настроен со следующими гибкими возможностями: (1) Разведение сыворотки может быть организовано либо по строке, либо по столбцу (Рисунок 2). Каждая сыворотка должна занимать отдельную строку или столбец. (2) Приращение разведения сыворотки является гибким, но оно должно начинаться с самой высокой концентрации сыворотки в верхнем левом углу пластины. (3) Количество дубликатов уравновешивает количество антисырок. Большее количество дубликатов может помочь сгладить экспериментальные вариации. (4) Количество дубликатов VC и количество дубликатов элемента управления (CC) являются гибкими, но они также должны находиться в отдельных строках или столбцах. Ожидается, что количество дубликатов VC значительно больше, чем у антисывороток.
- Подготавливаем ячеечный монослой, как в пунктах 1.1-1.3, за 2 или 3 дня.
- Добавьте по 50 мкл VGM в каждую лунку пластины.
- Используйте столбцы 11 и 12 для VC и CC соответственно. Добавьте 50 мкл аликвот сыворотки, обработанной рецептор-разрушающим ферментом (RDE) 1:20, в первую строку (A) столбцов 1-10.
заметка: Для каждой комбинации вируса и сыворотки анализ выполняется в двух экземплярах, поэтому одна пластина может, например, содержать один вирус, протестированный на пять антисывороток.
- Выполните 2-кратное серийное разведение путем переноса 50 мкл из строки A в строку H (столбцы 1-10 на рисунке 2) и отбрасывания 50 мкл из строки H.
- Добавьте по 50 мкл разбавителя в каждую лунку колонки CC (столбец 12 на рисунке 2).
- Добавьте по 50 мкл вируса в каждую лунку планшета, за исключением столбца CC (столбцы 1-11, строки A-H на рисунке 2).
- Инкубируйте его при температуре 37 °C в течение 2-3 часов. Удалите инокулянт. Добавьте накладку (200 мкл) в каждую лунку. Инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 °C, не беспокоя. Зафиксируйте и окрасьте пластины в соответствии с титрованием вируса (шаги 1.11-1.22).
3. Количественная оценка нейтрализации
- Поместите планшет для лунок в область сканирования планшетного сканера, как показано на рисунке 2a. Используйте L-образный предел положения для обеспечения оптимального и воспроизводимого местоположения изображения.
заметка: За одно сканирование можно получить изображение двух луночных планшетов.
- Отсканируйте пластину.
- Запустите программное обеспечение "Wellplate Reader" для расчета необходимых титров вируса (Рисунок 3).
- Нажмите кнопку "Загрузить изображение", чтобы загрузить изображение. Сдвиньте красную полосу в поле «Глобальный порог», чтобы настроить порог выборки. Нажмите кнопку "Обновить", чтобы проверить эффект.
- Отметьте галочкой поле «Рассчитать нейтрализацию/титрование». Нажмите кнопку «Выборка», чтобы количественно определить ICP. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить результаты отбора проб при появлении запроса.
заметка: После процесса отбора проб автоматически появляется новое окно под названием «Расчет нейтрализации и титрования», если установлен флажок «Рассчитать нейтрализацию/титрование».
- Загрузите или введите карту пластин скважины. Укажите пороговое значение (например, 50%) в поле «Нейтрализация: вычет инфекции (%)».
- Выберите «Процесс нейтрализации» для расчета титров. Проверьте титры и нажмите кнопку "Сохранить и закрыть", чтобы сохранить результаты нейтрализации.
заметка: Нейтрализация описывается как обратная величина наибольшего разведения сыворотки крови с заранее определенным снижением ВЧД (например, 50% или 80%) по отношению к ВК (среднее значение столбца 11 на рисунке 4). В репрезентативных результатах использовалось снижение ПМС на 50%.
