Количественная оценка активности объемной аутофагической секвестрации в клетках млекопитающих

Аннотация

Источник: Luhr, M. et al., Анализ секвестрации лактатдегидрогеназы — простой и надежный метод определения активности объемной аутофагической секвестрации в клетках млекопитающих. J. Vis. Exp. (2018)

Видео демонстрирует анализ для оценки активности массового аутофагического секвестрации в клетках млекопитающих. Он использует электропорацию для высвобождения цитозольных белков, включая лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Секвестрированные фракции ЛДГ и суммарные клеточные фракции ЛДГ определяются для оценки секвестрации ЛДГ, что дает представление об общей активности объемной секвестрации.

Протокол

1. Посев и лечение клеток

1. Культивируйте адгезивные клетки в колбах для культуры тканей размером 75^см2 в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C, используя предпочтительную питательную среду для рассматриваемого типа клеток. Дайте клеткам расти до тех пор, пока они не достигнут почти сливающегося клеточного слоя.
   заметка: Используйте среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для клеток LNCaP, HEK293, эмбриональных фибробластов мышей (MEF), BJ, MCF-7 и RPE-1.
   1. Промойте клетки 3 мл 37 °C фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4. Замените PBS на 3 мл 0,25% (w/v) трипсина-этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) и инкубируйте колбу во влажном инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C до тех пор, пока клетки не отделятся (2–5 мин).
   2. Ресуспендируйте отделенные клетки питательной средой объемом 7 мл, содержащей 10% FBS. Смешайте аликвоту суспензии клеток объемом 10 мкл с 10 мкл 0,4% трипана синего в микроцентрифужной пробирке с помощью наконечника для дозатора объемом 0,5–20 мкл. Используйте тот же наконечник для дозатора для немедленного заполнения предметного стекла счетной камеры и подсчета клеток в автоматическом счетчике клеток.
2. Приготовьте подходящее разведение (см. примечание ниже) клеточной суспензии из стадии 1.1.2 с использованием питательной среды, содержащей 10% FBS, и засейте 1 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета для культуры тканей (площадь поверхности ~3,8^см2) с использованием асептического метода. Допускайте рост в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток, например, 60–90% слияние при сборе урожая.
   заметка: Соответствующее разведение клеточной суспензии, которое обеспечит желаемое слияние клеток при сборе, будет варьироваться от типа клетки к типу клетки, а также в зависимости от продолжительности и типа экспериментального лечения. Таким образом, это должно быть эмпирически оценено в каждом конкретном случае.
   1. Для экспериментов, которые должны быть обработаны и собраны через 2 дня после посева, в каждую лунку 12-луночного планшета следует засеять 2,5 x 10 5 LNCaP, HEK293 или MCF-7 клеток, 5 x 10⁴ MEF, 4 x 10⁵ BJ или 1,5 x 10⁵ клеток RPE-1.
   2. Для клеток, которые неплотно прилипают, покройте пластины типом покрытия, рекомендованным для рассматриваемого типа клетки. Для клеток LNCaP (и HEK293) используйте пластины, покрытые поли-D-лизином (PDL).
   3. С этой целью добавьте 500 мкл PDL в концентрации 2,5 мкг/мл в стерильном H₂O в каждую лунку и инкубируйте планшеты в стерильной среде в течение 30 мин при комнатной температуре (20–25 °C). Удалите PDL с помощью отсасывания, и кратко промойте каждую лунку 1 мл стерильного H₂O.
      заметка: Как правило, шаг 1.2.1 выполняется без каких-либо экспериментальных обработок. Однако при выполнении РНК-интерференции может быть удобно начать обратную трансфекцию с посева.
3. Выполняйте экспериментальные обработки в дублирующих или тройных скважинах для каждого состояния.
   1. Например, обрабатывают клетки 50 нМ ингибитора mTOR Torin1, который, как правило, является эффективным индуктором аутофагической секвестрации, или подвергают клетки острому сывороточному и аминокислотному голоданию, промывая клетки 1 мл безаминокислотной среды Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), а затем инкубируют клетки в 1 мл EBSS в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом (_CO2) при 37 °C.
   2. Оставьте один набор лунок необработанным, чтобы определить фоновые уровни осадочной лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
   3. Добавьте насыщающее количество ингибитора постсеквестрации бафиломицина А1 (Baf) в отсутствие или в присутствии экспериментальных методов лечения за 3–4 ч до сбора клеток. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C.
      1. Используйте 100 нМ Baf для элементов LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 и RPE-1 и 10 нМ Baf для MEF.
      2. Для экспериментальных обработок, продолжительность которых составляет всего 3–4 часа (как в примере 1.3.1), добавляйте Baf одновременно с процедурами. Для более длительных экспериментальных обработок подождите 3-4 часа перед сбором урожая и добавьте 2 мкл 500-кратного концентрированного бульона Baf непосредственно в среду.
      3. Перемешайте, перемешивая пластину сразу после добавления баба. На этом этапе также рекомендуется добавлять макроаутофагические ингибиторы секвестрации в качестве контроля, например, 10 мМ ингибитора пан-фосфоинозитида 3-киназы (PI3K) 3-метиладенина (3MA) или 10 мкМ селективного ингибитора PI3K класса III SAR-405.

2. Сбор клеток и подготовка к электроразрушению

1. В конце периода лечения отсасывайте среду с помощью отсасывания и добавьте в каждую лунку 200 мкл раствора для отсоединения клеток (предварительно нагретого до 37 °C). Инкубировать при температуре 37 °C до тех пор, пока клетки не отделятся (обычно около 5 мин).
   заметка: В то время как 0,25% (w/v) трипсин-ЭДТА может быть использован вместо раствора для отслойки клеток, последний содержит ДНКазу, которая помогает снизить вязкость отделенных клеток. До тех пор, пока среда тщательно аспирирована, нет необходимости промывать клетки перед добавлением Трипсина-ЭДТА или раствора для отслойки клеток.
2. Добавьте в каждую лунку 500 мкл PBS комнатной температуры (20-25 °C), pH 7,4, содержащий 2% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA), и повторно суспендируйте с помощью пипетки до тех пор, пока не исчезнут клеточные комки. Немедленно перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл на льду.
   заметка: Если не указано иное, все последующие действия выполнять на льду.
3. Отсадите клетки центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
4. Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость (с помощью отсасывания), чтобы гранулы клетки оставались как можно более сухими.
5. Добавьте 400 μL 10% (w/v) сахарозы (в сверхчистом H2 O) в каждую пробирку.

3. Электроразрушение плазматической мембраны и разделение седиментируемых и общих клеточных фракций

1. Повторно суспендируйте клеточную гранулу с помощью пипетки, чтобы получить суспензию, близкую к одноклеточной, и перенесите ее в 4-миллиметровую электропорационную кювету.
   заметка: Обычно достаточно пипетирования вверх и вниз ~10–15 раз с использованием наконечника для дозатора объемом 100–1000 мкл.
2. Поместите кювету в электропоратор с экспоненциальной волной затухания и разрядите один электрический импульс при напряжении 800 В, 25 мкФ и 400 Ω; эти настройки выдадут импульс длительностью ~8 мс.
3. С помощью нового наконечника для пипетки перенесите клеточный деструкт в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 400 мкл ледяного раствора сахарозы, буферизованного фосфатами (100 мМ монофосфата натрия, 2 мМ дитиотреитола (DTT), 2 мМ ЭДТА и 1,75% сахарозы, pH 7,5), и кратко перемешайте с помощью пипетирования.
   1. Дополнительно: Чтобы проверить эффективность электроразрушения плазматической мембраны, смешайте 10 мкл разбавленной клеточной диструза из стадии 3.3 с 10 мкл 0,4% трипанового синего в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Переложите в камеру для подсчета и убедитесь, что процент положительных клеток Trypan Blue составляет >99%.
      1. Оставьте образец в камере для подсчета на 30 минут при комнатной температуре (20–25 °C) и убедитесь, что процент положительных клеток Trypan Blue остался >99%.
   2. Необязательно: Чтобы убедиться, что электроразрушение не было слишком резким, то есть не разрушило внутриклеточные органеллы, выполните шаги 1.1–3.3, как описано выше, но используйте более крупный исходный материал (лунку из 6-луночного планшета с ~80% сливающимся клеточным слоем) и используйте 150 мкл 10% сахарозы на этапе 2.5 и 150 мкл фосфатно-буферного раствора сахарозы без DTT на шаге 3.3.
      1. С помощью пипетки тщательно нанесите 200 мкл разбавленного раствора для разрушения клеток поверх 1,2 мл буферной плотности фосфатно-буферизованной среды с 8% (по объему) градиентной среды плотности (например, 8% никоденца, 50 мМ фосфата натрия, 2,2% сахарозы, 1 мМ ЭДТА) в центрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифугируйте при давлении 20 000 x g в течение 45 мин при 4 °C в микроцентрифуге с функцией мягкого режима (для мягкого ускорения и замедления) и осторожно положите пробирки на лед.
      2. Осторожно удалите 60 μL из ~200 μL верхней фракции, следя за тем, чтобы не набрал раствор среды с градиентом плотности, и переложите в свежую микроцентрифужную пробирку.
         заметка: Он должен содержать цитозоль исключительной чистоты, называемый «клеточным соком».
      3. Проверьте чистоту фракции, полученной на предыдущем этапе, путем проведения вестерн-блоттинга белков, содержащихся в органеллах, с использованием стандартных методов и гелей с градиентом 4–20%.
      4. Пройдите, например, иммуноблоттинг на катепсин В, цитохром с и протеиндисульфидизомеразу, чтобы убедиться, что электрошок на этапе 3.2 не нарушил лизосомы, митохондрии или эндоплазматический ретикулум, соответственно, и иммуноблоттинг на ЛДГ, чтобы проверить наличие цитозольного белка в клеточном соке.
      5. Параллельно с этим проведите иммуноблоттинг белковых экстрактов, полученных из раствора полного клеточного разрушения, чтобы подтвердить, что используемые антитела могут обнаруживать белки, содержащиеся в органеллах, которые оцениваются.
4. Повторите шаги 3.1–3.3 для каждого образца.
5. Удалите 550 мкл из каждого разбавленного раствора для разрушения клеток (полученного на стадии 3.3) в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, содержащие 900 мкл ледяного ресуспензионного буфера (50 мМ монофосфата натрия, 1 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА и 5,9% сахарозы, pH 7,5) с добавлением 0,5% BSA и 0,01% Tween-20, и кратко перемешайте с помощью пипетирования.
6. Центрифугируйте при 18 000 x g в течение 45 минут при 4 °C для получения гранул, содержащих «осажденный LDH». Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость (с помощью всасывания), чтобы гранулы оставались как можно более сухими. Поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C.
7. Перелейте 150 мкл из каждого разбавленного раствора для разрушения ячеек (полученного на шаге 3.3) в новые пробирки и поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C. Используйте эти образцы для определения «общего уровня ЛДГ» в клетках.
   заметка: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен на сколь угодно долгий срок.

4. Экстракция ЛДГ и измерение ферментативной активности ЛДГ

1. Разморозьте на льду образцы «осажденного ЛДГ» (из шага 3.6) и «общего ЛДГ» (из шага 3.7).
2. Добавьте 300 мкл ледяного ресуспензионного буфера, содержащего 1,5% Triton X-405, к образцам «общего LDH» (в результате чего конечная концентрация Triton X-405 составила 1%). Вращайте образцы на валике в холодном помещении (4–8 °C) в течение 30 минут.
3. Добавьте 750 мкл ледяного буфера для ресуспензии с 1% Triton X-405 в образцы «осажденного LDH» и повторно суспендируйте гранулы с помощью пипетки до получения однородного раствора.
4. Центрифугируйте образцы из этапов 4.2 и 4.3 при 18 000 x g в течение 5 мин при 4 °C для осаждения нерастворенного клеточного мусора.
5. Смешайте 4 части холодного имидазола 65 мМ (рН 7,5)/0,75 мМ пирувата с одной частью холодного имидазола 65 мМ (рН 7,5)/1,8 мМ НАДН до получения рабочего раствора, стабильного в течение не менее трех недель при 4 °С.
6. Смешайте 3–30 мкл надосадочной жидкости из стадии 4.4 с 200 мкл рабочего раствора стадии 4.5.
7. Определите количество ЛДГ путем измерения ферментативной активности ЛДГ как снижения абсорбции никотинамидадениндинуклеотида (восстановленной формы) (НАДН) при 340 нм при 37 °C по сравнению со стандартом с известной концентрацией ЛДГ. Измеряйте поглощение до тех пор, пока реакция не приблизится к завершению, т.е. пока поглощение на длине волны 340 нм не перестанет изменяться со временем.
   заметка: Это классический биохимический метод измерения активности ЛДГ. Несмотря на то, что в соответствии с текущим протоколом реакция проводится при температуре 37 °C, она также может быть выполнена при комнатной температуре (20–25 °C), что целесообразно при проведении ручной спектрофотометрии. В текущем протоколе используется роботизированный мультианализатор, который автоматически смешивает образцы с рабочим раствором в 96-луночном планшете и измеряет поглощение на длине волны 340 нм при 37 °C каждые 20 с в течение 3 минут. После этого программное обеспечение прибора рассчитывает концентрацию ЛДГ, выраженную в единицах (Е)/л, сравнивая наклон измерений поглощения с течением времени по сравнению со стандартной кривой, полученной в результате калибровки, со стандартом известной концентрации ЛДГ. Линейная дальность обнаружения при таком подходе составляет 30–1500 Ед/л. В качестве альтернативы существует широкий спектр коммерчески доступных наборов для измерения ЛДГ. Некоторые из них основаны на связывании ферментативной реакции с получением колориметрических или флуоресцентных продуктов, что позволяет проводить детектирование с помощью других средств, помимо УФ-спектрофотометрии, а также с другими линейными диапазонами детектирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл и 2 мл	Эппендорф	211-2130 и 211-2120
12-луночные планшеты	сокол	353043
Решение Accumax для отслойки клеток	Инновационные клеточные технологии	А7089	Храните аликвоты при температуре -20 °C в течение многих лет, а в холодильнике в течение нескольких месяцев
Бафиломицин А1	Энцо	БМЛ-КМ110-0100	Растворение в ДМСО
Ячейки BJ	АТКС	ЦРЛ-2522	Использование при проезде <30
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	ВВР	422361В
Счетная камера Burker	Научный центр Фишера	139-658585 (Английский
Камеры подсчета клеток графини Слайды	ThermoFisher Scientfic	С10228
Автоматизированный счетчик ячеек Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Защитное стекло для счетной камеры Burker	Научный центр Фишера	139-658586 (Английский)
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-луночный, 15 μл, 13,3 x 8,7 см (Ш x Д)	Био-Рад	3450034
ДТТ	Сигма-Олдрич	Д0632
Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS)	Gibco	No 24010-043	Конатины 0,1% глюкозы
Эдта	Сигма-Олдрич	Е7889
Кювета для электропорации (4 мм)	Био-Рад	1652088
Электропоратор с экспоненциальной волной затухания	BTX Гарвардский аппарат	ЭМС 630
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	сигма	Ф7524	Конечная концентрация 10% в среде RPMI 1640
Элементы HEK293	АТКС	ЦРЛ-1573
Имидазол	Сигма-Олдрич	No 56750	Автоклавируйте раствор 65 мМ и храните в холодильнике месяцами
инкубатор; СО2-инкубатор Autoflow IR с прямым нагревом	НуАйре	НУ-5510Э
Липофектамин РНКиМАКС Реагент для трансфекции	ТермоФишер	13778150
Элементы LNCaP	АТКС	ЦРЛ-1740	Использование при проезде <30
3-метиладенин (3MA)	Сигма-Олдрич	М9281	Запас 100 мМ в RPMI при температуре -20 °C. Нагрейте запас до 65 °C в течение 10 минут и используйте при конечной концентрации 10 мМ
Рефрижераторная микроцентрифуга	Beckman Coulter Медико-биологические науки	368831
Охлаждаемая микроцентрифуга с функцией мягкого режима	Эппендорф	Эппендорф 5417R
MRT67307 гидрохлорид (ULKi)	Сигма-Олдрич	SML0702	Ингибирует активность УЛК-киназы. Раствориться в ДМСО.
Мультианализатор MaxMat	Эрба Диагностика	ПЛ-II
Элементы MCF7	АТКС	ХТБ-22
Надн	Мерк-Миллипор	1.24644.001
Nycodenz	Ось-Щит	1002424
Opti-MEM Средство для пониженной сыворотки	ТермоФишер	31985062
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco	20012-019
Наконечники для пипеток 3 (0,5-20 мкл)	ВВР	732-2223	Насадки Thermo Fischer ART Barrier
Наконечники для пипеток (1-200 μл)	ВВР	732-2207	Насадки Thermo Fischer ART Barrier
Наконечники для пипеток (100-1000μл)	ВВР	732-2355	Насадки Thermo Fischer ART Barrier
Пипетки	ТермоФишер	4701070	Набор Finnpipette F2 GLP
Поли-D-лизин	Сигма-Олдрич	П6407-10С5МГ	Приготовьте стоковый раствор 1 мг/мл в стерильном H2O. Этот раствор стабилен при температуре -20 °C в течение как минимум 1 года.
Пируват	Мерк-Миллипор	1066190050
Клетки RPE-1 (hTERT RPE-1)	АТКС	ЦРЛ-4000
РПМИ 1640	Gibco	No 21875-037
SAR-405	АпексБио	А8883	Ингибирует фосфоинозитид-3-киназу III класса (PIK3C3). Раствориться в ДМСО.
Выбор глушителя Negative Control #1 (siCtrl)	ТермоФишер/Амбион	4390843
Silencer Select ATG9-нацеленная миРНК (siATG9A)	ТермоФишер/Амбион	С35504
Silencer Select FIP200-нацеленная миРНК (siFIP200)	ТермоФишер/Амбион	С18995
Silencer Select ULK1-нацеленная миРНК (siULK1)	ТермоФишер/Амбион	С15964
Silencer Select ULK2-нацеленная миРНК (siULK2)	ТермоФишер/Амбион	С18705
Silencer Select GABARAP-нацеленная миРНК (siGABARAP)	ТермоФишер/Амбион	С22362
Silencer Select GABARAPL1 нацеленная миРНК (siGABARAPL1)	ТермоФишер/Амбион	С24333
Silencer Select GABARAPL2 миРНК (siGABARAPL2)	ТермоФишер/Амбион	С22387
Одноосновной дигидрат фосфата натрия (NaH2PO4 • 2H2O)	Мерк-Миллипор	1.06580.1000
Двухосновной дигидрат фосфата натрия (Na2HPO4 • 2H2O)	Пролабо	No 28014.291
сахароза	ВВР	443816Т	Конечная концентрация 10% в воде; профильтровать через фильтр 0,45 мкм и хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев.
Тапсигаргин	Сигма-Олдрич	Т9033	Ингибирует насос SERCA ER Ca2+. Раствориться в ДМСО.
Тритон Х-405	Сигма-Олдрич	Х405	1% итоговый
Морилка Трипан Синий 0.4%	Молекулярные зонды	Т10282
Трипсин-ЭДТА (0,25% по отношению к трипсину)	Gibco	No 25200-056
Подросток-20	Сигма-Олдрич	П2287	0,01% итоговый