1. Условия культивирования зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующего M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется ауксотрофный штамм M. tuberculosis H37Rv, полученный из M. tuberculosis (ΔpanCD, ΔleuCD), трансформированный с помощью gfp (зеленого флуоресцентного белка), экспрессирующего плазмиду pMN437. Можно заменить штамм Mtb-GFP штаммом, не экспрессирующим дикий тип, чтобы обеспечить более легкий доступ к штамму для исследователей. Тем не менее, экспрессия gfp желательна для обеспечения визуального подтверждения фагоцитоза и образования агрегатов Mtb/макрофагов. Для длительного хранения Mtb-GFP замораживали при -80 °C в полной среде 7H9 (описанной на шаге 1.1) с добавлением 20% глицерина.
- Приготовьте полноценную среду Mtb-GFP (7H9-C), добавив среду 7H9 с 10% Middlebrook OADC (олеиновый альбумин декстроза каталазы), 0,02% тилоксапола, 24 мкг/мл D-пантотеновой кислоты, 50 мкг/мл L-лейцина и 50 мкг/мл гигромицина B.
- Разморозьте один флакон Mtb-GFP и добавьте 10 мл 7H9-C в колбу PETG с квадратным дном объемом 30 мл.
- Инкубировать при 37 °C на ротационном встряхивателе (50 об/мин). Измеряйте оптическую плотность (наружный диаметр600) каждые несколько дней, пока наружный диаметр600 не достигнет 1,0 (примерно 5-8 дней).
- Разбавляйте и пропускайте культуру по мере необходимости для поддержания наружного диаметра600 в диапазоне 0,2-1,0.
- Для инфекции используйте установленную культуру Mtb-GFP в фазе логарифмического роста (OD600 от 0,6-1). Чтобы избежать образования комков, облучайте колбу с культурой Mtb на водяной бане (130 Вт; 3 x 5 с импульсов) один или два раза в неделю.
2. Условия культивирования клеток THP-1
- Приготовьте полную клеточную среду THP-1 (RPMI-C) путем добавления среды RPMI 1640 с 10% инактивированной тепловой фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота).
- Инкубируйте клетки в колбе Т-75 при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5%.
- Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра или проточной цитометрии через день и поддерживайте плотность клеток THP-1 в диапазоне от 0,1 до 0,6 миллиона на мл.
3. Протокол заражения для генерации структур mtb/макрофагов
- Клеточный препарат THP-1 (на 96-луночный планшет)
- Центрифугируйте 7 x 106 THP-1 клеток при 250 x g в течение 5 мин. Ресуспендируйте в 7 мл RPMI-C.
- Подготовка МТБ-ГФП
- Центрифуга 2,8 x 108 Mtb-GFP при 3 200 x g в течение 5 мин в центрифуге с качающимся ведром с использованием преобразования наружного диаметра600 1,0 = 3 x 108 бактерий/мл.
- Вымойте один раз с помощью RPMI-C и центрифуги, как в шаге 3.2.1.
- Ресуспендирование в 7 мл RPMI-C и вихрь на 10 с.
- Инфекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон см. на рисунке 1.
- Приготовьте планшет на 96 лунок, добавив 200 мкл стерильной воды в ряды A и H и столбцы 1 и 12 для водяного обода, чтобы предотвратить испарение питательной среды.
- Добавьте 200 μL RPMI-C в столбец 2 (от B2 до G2) для управления фоном (Blank).
- Чтобы заразить, добавьте суспензию Mtb-GFP (шаг 3.2) в клеточную суспензию THP-1 (шаг 3.1) и хорошо перемешайте с помощью пипетирования. Конечная плотность клеток THP-1 составляет 5 x 105 на мл, а соответствующая кратность инфекции равна 40.
- Налейте суспензию THP-1/Mtb-GFP в резервуар объемом 25 мл.
- Добавьте 200 мкл суспензии THP-1/Mtb-GFP во все оставшиеся 96 лунок (от B3 до G11) с помощью многоканальной пипетки.
заметка: При работе с несколькими 96-луночными планшетами регулярно ресуспендируйте оставшуюся суспензию THP-1/Mtb в резервуаре, чтобы обеспечить равномерное добавление смеси в каждую скважину.
- Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 7-10 дней.
- Меняйте среду каждые 2 дня, медленно удаляя 100 мкл отработанной среды с верхней части каждой лунки и осторожно добавляя 100 мкл предварительно подогретой RPMI-C с помощью многоканальной пипетки. Не допускайте повторной суспензии в скважинах и не нарушайте агрегаты Mtb/макрофагов на дне скважин.
- Ежедневно визуально осматривайте лунки с помощью флуоресцентной микроскопии (объектив 4-10X), обращая внимание на размер агрегатов Mtb/макрофагов. К 7-10-му дню агрегаты Mtb/макрофагов должны стать достаточно большими (см. Рисунок 2 для справки), чтобы можно было приступить к тестированию эффективности препарата (Раздел 4).
- При желании можно получить изображения 96 лунок с помощью автоматизированной системы визуализации ячеек, оснащенной наборами фильтров яркого поля и GFP, чтобы задокументировать образование агрегатов Mtb/макрофагов.
заметка: Если у пользователей нет доступа к автоматизированной системе визуализации, изображения репрезентативных лунок могут быть сделаны с помощью любого подходящего микроскопа с возможностью GFP и яркого поля.
4. Анализ ингибирования роста для оценки эффективности препарата против МТБ, полученного из агрегатов МТБ/макрофагов
- Лекарственная подготовка (тройные условия для двух препаратов)<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон см. на рисунке 1A.
- В отдельный 96-луночный планшет добавьте 125 мкл среды 7H9-C к B2 до G10.
- Приготовьте два препарата с максимальной максимальной конечной концентрацией в 1 мл 7H9-C в два раза выше желаемой концентрации для учета разведения, указанного на стадии 4.2.4.
- Добавьте по 250 мкл каждого препарата в лунки B11-C11-D11 и E11-F11-G11 соответственно для тройных обработок.
- Используя многоканальную пипетку, последовательно разбавляйте исследуемые препараты в два раза, перемещая 125 мкл из B11-G11 в B10-G10. Перемешивайте пипеткой 5 раз на каждом этапе.
- Продолжайте перемещать 125 мкл от столбца к столбцу (справа налево) по пластине и остановитесь после столбца 4.
- После смешивания в колонке 4 слейте 125 μL в контейнер для отходов. Столбцы 2 и 3 не должны содержать никаких лекарственных препаратов, позволяющих использовать их в качестве фона (пробел) и положительных средств контроля роста.
заметка: В качестве альтернативы следуйте шаблону на рисунке 1B для тестирования библиотек лекарств. Каждый 96-луночный планшет может вместить 58 препаратов в одной концентрации. Приготовьте эту лекарственную пластину, используя двойную желаемую конечную концентрацию, так как на шаге 4.2.4 она будет разбавлена пополам.
- Медикаментозное лечение:
- Извлеките 96-луночный планшет, содержащий Mtb-инфицированные макрофаги (агрегаты Mtb/макрофагов).
- Тщательно сцедите все соответствующие лунки (от B2 до G11) с помощью многоканальной пипетки. Выполните это в два этапа: сначала удалите 150 μЛ, не наклоняя пластину, а затем удалите оставшуюся среду (~50 μЛ), наклонив пластину и вставив наконечник пипетки в нижний край лунки. Поскольку агрегаты Mtb/макрофагов прилипают к дну скважины, материал не должен теряться.
- Аккуратно добавьте 100 мкл среды 7H9-C во все соответствующие лунки (от B2 до G11) планшета, содержащего агрегаты Mtb/макрофагов.
- С помощью многоканальной пипетки перенести 100 мкл из содержащей препарат 96-луночной пластины (шаг 4.1) в соответствующие лунки инфекционной пластины.
- Поместите в герметичный пакет и выдерживайте в течение 3 дней при 37 °C.
5. Количественная оценка эффективности лекарства с помощью анализа микротитров резазурина
- Приготовьте стоковый раствор резазурина в конечной концентрации 0,8 мг/мл вH2O. Профильтруйте через мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) размером 0,22 мкм для стерилизации.
- Приготовьте рабочий раствор резазурина, смешав исходный раствор резазурина H2O и Tween-80 (20% раствор в H2O) в соотношении 2:1:1. Конечные концентрации составляют 0,4 мг/мл резазурина и 5% Tween-80.
- С помощью планшетного ридера настройте программу для считывания флуоресценции при возбуждении 530 нм и излучении 590 нм каждые 30 мин в течение 24 ч при 37 °C. Предварительно нагрейте планшетный ридер до 37 °C.
- Добавьте 20 мкл рабочего раствора резазурина во все соответствующие лунки (от B2 до G11) обработанной лекарственным препаратом пластины (шаг 4.11) с помощью многоканальной пипетки.
- Поместите пластину на считыватель пластин и запустите программу, настроенную на шаге 5.3.
заметка: Для облегчения обработки больших объемов пробирных планшетов достаточно проявлять анализ в инкубаторе при температуре 37 °C и выполнять однократные флуоресцентные чтения каждые 24 часа. Это также относится к пользователям, у которых нет доступа к считывателю планшетов с кинетическими и инкубационными возможностями.
