Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. День 1
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все описанные ниже шаги в стерильном шкафу биобезопасности с ламинарным потоком, используемом для культивирования тканей в лаборатории BSL-2.
- Разморозьте образцы сыворотки при комнатной температуре и перенесите 100 μл каждого образца сыворотки в стерильную пробирку. Нагрейте в течение 30 минут при температуре 56°C на водяной бане или термомиксере с регулируемой температурой. Сделайте 10-кратное серийное разведение образца сыворотки в диапазоне от 1:1 до 1:1000 с использованием холодного RPMI-10 (RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки).
- Перенесите 10 мкл последовательно разведенного образца сыворотки в каждую лунку стерильного 96-луночного планшета с V-образным дном. Включите два комплекта контрольных лунок: RPMI-10 только с RVP и без образца сыворотки и RPMI-10 только без RVP и без образца сыворотки. Настройте каждый образец сыворотки и контрольные значения RPMI-10 в трех экземплярах.
- Достаньте RVP Денге-1, 2, 3 и 4 из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте их на водяной бане при температуре 37 °C. Переложите размороженные РВП сразу на лед. Получите приблизительно 170 μL RVP для каждого образца сыворотки (10 μL RVP x 3 лунки для каждого разведения сыворотки (1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000) и 10 μL RVP x 3 лунки для каждой из RPMI-10 с контрольными лунками только RVP).
- Пипетку по 10 мкл RVP в каждую лунку 96-луночного V-образного планшета, содержащего образец сыворотки, и в контрольные лунки RPMI-10 с RVP (без сыворотки). Не добавляйте РВП только в лунки RPMI-10 (без образца сыворотки и без РВП). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5–10 раз. Добавляйте 10 мкл холодного RPMI-10 вместо RVP в каждую холодную контрольную лунку RPMI-10 (без образца сыворотки и без RVP).
- Перенесите 96-луночный планшет с V-образным дном в инкубатор и инкубируйте планшет в течение 1 часа при температуре 37 °C в присутствии 5%CO2. Во время инкубации 96-луночной пластины с V-образным дном очистите поверхность шкафа биобезопасности 70% этанолом и включите ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут.
- Извлеките из инкубатора полностью совпадающую колбу с клетками K562 T75, хорошо перемешайте клетки с помощью стерильной пипетки объемом 5 мл и переложите 5 мл клеток в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Клетки K562 поддерживаются в RPMI-10 и субкультивируются в концентрации 1 x 106/мл.
- Подсчитайте количество клеток, удалив 10 мкл клеток из стерильной конической пробирки объемом 15 мл, и смешайте с 10 мкл трифанового синего. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток в конической трубке объемом 15 мл.
- Центрифугируйте коническую жидкость объемом 15 мл с клетками при концентрации ~1200 x g в течение 10 минут, сцеживайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в теплой среде RPMI-10 в концентрации 80000 клеток/30 μл среды (2,66 x 106 клеток/мл).
- Извлеките из инкубатора 96-луночную пластину с V-образным дном (шаг 1.6), перенесите по 30 мкл клеток K562 в каждую лунку 96-луночной пластины с V-образным дном и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5–10 раз. Перенесите 96-луночный планшет с V-образным дном в инкубатор и инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 °C в присутствии 5%CO2.
- После инкубации в течение 1 часа извлеките 96-луночную пластину с V-образным дном из инкубатора и центрифугируйте при давлении ~1 200 x g в течение 5 минут. После центрифугирования сцедите среду из лунок, перевернув пластину вверх дном в емкость, содержащую 10% отбеливателя.
- Промойте клетки в каждой лунке, повторно суспендируя их в 125 μл теплой RPMI-10, тщательно перемешайте пипеткой и центрифугируйте пластину при температуре ~1,200 x g в течение 5 мин. Сцедите среду, перевернув пластину вверх дном в контейнер с 10% отбеливателем. Повторите этот шаг стирки два раза.
- После промывки добавьте в каждую лунку по 100 мкл теплого RPMI-10, перемешайте с пипеткой и выдержите планшет в течение 48 ч при 37 °C в присутствии 5%CO2.
2. День 3
- Извлеките из инкубатора 96-луночную пластину с V-образным дном, содержащую 100 μл клеток и среды/лунки, и переместите ее в шкаф для биобезопасности. С помощью многоканальной пипетки смешайте содержимое каждой лунки и перенесите элементы и среду на 96-луночный U-образный планшет или предварительно маркированные полипропиленовые пробирки объемом 5 мл.
- Промойте каждую лунку в 96-луночном планшете с V-образным дном 100 μл 1% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) и перенесите в соответствующие лунки в 96-луночной U-образной нижней пластине или маркированных 5 мл полипропиленовых пробирках с этапа 2.1 до получения конечной концентрации 0,5% PFA на лунку или пробирку. Тщательно перемешайте с помощью многоканальной пипетки, накройте пластину алюминиевой фольгой и оставьте в инкубаторе на 30 минут для фиксации ячеек.
- Подготовьте проточный цитометр (см., например, Таблицу материалов), запустив неокрашенные клетки K562 для калибровки бокового и прямого рассеяния вместе с настройками флуоресценции. Единственным необходимым флуоресцентным каналом является FL1, так как GFP является единственной флуоресценцией, излучаемой клетками. Получите ~30 000–50 000 клеток из каждого образца.
заметка: Для получения данных можно использовать любой проточный цитометр, способный считывать одну флуоресценцию, поскольку клетки, инфицированные RVP, будут излучать только зеленую флуоресценцию из-за присутствия GFP, и никаких других флуоресцентных каналов не требуется.
3. Анализ данных
- Анализируйте данные, полученные на проточном цитометре, с помощью любого программного обеспечения для анализа проточной цитометрии (см. Таблицу материалов).
- Установите первый вентиль на основе FSC-A (прямое рассеяние – площадь) и FSC-H (прямое рассеяние – высота), чтобы включить одиночные ячейки и исключить автофлуоресцентные дублеты из анализа. Затем затворяют синглетно-зависимые элементы на основе SSC-A (боковое рассеяние – площадь) против FSC-A для исключения автофлуоресцентного мусора.
- Анализ SSC-A и FSC-A гейтированных клеток на экспрессию GFP на основе SSC-A и GFP-A. Определите процент клеток GFP+ для каждого разведения сыворотки и контрольных образцов, установив ворота вокруг клеток GFP+.
- Определите средний процент клеток GFP+ для каждой пробы, разведенной и контрольной лунок, разделив общий процент клеток GFP+ в тройных лунках на 3.
- Рассчитайте кратное усиление инфекции путем деления среднего процента клеток GFP+ в образцах сыворотки для каждого разведения на средний процент клеток GFP+ в контрольных лунках RPMI-10 с RVP (без образца сыворотки).
- Увеличение сворачивания графика (ось y) в сравнении с разбавлением (ось x) и выполнение статистического анализа с использованием ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки для множественных сравнений.
