1. Скрининг потенциальных наноингибиторов TLR4 с использованием репортерных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку передача сигналов TLR4 использует оба MyD88-зависимых наземных TRIF-зависимых пути, она выбрана в качестве основной цели для охвата широкого спектра сигнальных путей TLR. Репортерные ячейки THP-1-XBlue используются в основном для изучения активации NF-κB/AP-1, в то время как ячейки THP-1-Dual используются для активации IRF от TRIF-зависимой сигнальной трансдукции.
- Определите оптимальную дозу ЛПС путем построения кривой «доза-реакция» до проведения скрининга.
- Рабочий раствор ЛПС развести до конечной концентрации 0,01 - 100 нг/мл в среде R10 (развести в масштабе log10). Разметьте конструкцию планшета и произведите разведение в 96-луночном культуральном планшете с круглым дном. Следите за тем, чтобы в каждой лунке было минимум 110 мкл раствора после разбавления.
- Аккуратно удалите питательную среду из засеянной клетки пластины с помощью вакуумного аспиратора.
- ЛПС, содержащую среду R10, приготовленную в планшете для разбавления (1.1.1), переносят в культуральный планшет в соответствии с расположением образцов. Инкубировать планшет при температуре 37 °C (в инкубаторе для клеточных культур) в течение 24 ч.
- Через 24 ч осторожно перенесите надосадочную жидкость (80 мкл/лунка) в новую 96-луночную пластину с круглым дном. Проведите колориметрический и/или люциферазный люминесцентный анализ этих растворов немедленно или храните их при температуре 4 °C (несколько часов) или -20 °C (дней) до разработки анализа.
заметка: Дизайн схемы пластин должен быть простым и понятным для эксперимента и анализа данных. Для каждого условия следует рассмотреть 2-4 повторения. Всегда включайте отрицательную контрольную группу (LPS null). Рекомендуется использовать клетки THP-1-XBlue для активации NF-κB/AP-1, поскольку двойные клетки имеют относительно высокий фон активации NF-κB/AP-1 после дифференцировки в макрофаги. Тем не менее, можно использовать двойные ячейки для сообщения об активации как NF-κB/AP-1, так и IRF.
- Разработка колориметрического анализа для активации NF-κB/AP-1 и люминесцентного анализа для активации IRF.
- Чтобы оценить активацию NF-κB/AP-1, перенесите 20 мкл надосадочной жидкости каждого образца в новую 96-луночную культуральную тарелку с плоским дном и добавьте 180 мкл предварительно подогретого субстрата SEAP в каждую лунку. Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение 1 - 2 часов, чтобы цвет развился (от розового до темно-синего). Соберите поглощение на длине волны 655 нм на считывателе пластин.
осторожность: Время инкубации может варьироваться в зависимости от развития окраски (от 30 минут до ночной инкубации). Рекомендуется подождать, пока оптическая плотность (O.D.) самого темного цвета не превысит 1, избегая при этом насыщенности развития цвета (O.D >3).
- Для анализа активации IRF перенесите 10 мкл надосадочной жидкости каждого образца в 96-луночный прозрачный белый планшет с плоским дном. Добавьте раствор люциферазы (50 μл) и сразу же хорошо соберите люминесценцию.
заметка: Настоятельно рекомендуется использовать считыватель люминесцентных пластин с функцией автоматического впрыска для обеспечения постоянства показаний люминесценции от скважины к скважине и от пластины к пластине. Если растворы субстрата вводятся вручную, обеспечьте постоянное время инкубации и настройку показаний для каждой лунки.
- Провести скрининговый анализ на различных пептидах-ГНП-гибридах со стимуляцией ЛПС 10 нг/мл (на основе 1.1). Выполните ту же процедуру, что и в 1.2, для разработки отчетного анализа.
- Концентрируйте гибриды пептид-ГНП до 200 нМ в среде R10 методом центрифугирования. Центрифугируйте 20 объемов гибридного раствора (10 нМ) при давлении 18 000 x g в течение 30 мин и тщательно выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гибриды (на дне пробирки) в пробирку, дважды промойте их PBS и повторно суспендируйте гибриды в одном объеме среды R10.
- Смешайте равные объемы концентрированных гибридов и ЛПС (20 нг/мл), содержащую среду R10, чтобы конечная концентрация гибридов и ЛПС составила 100 нМ и 10 нг/мл соответственно.
- Удалите питательную среду из культивируемого планшета и добавьте по 100 мкл смешанного раствора в каждую лунку (по 3 повторения для каждого условия); включите отрицательный контроль (только среда) и контроль ЛПС (10 нг/мл ЛПС без гибридов).
- После 24-часовой инкубации при 37 °C переложите среду из каждой лунки в пробирку и центрифугируйте пробирки при 18 000 x g, 4 °C в течение 30 мин. Соберите надосадочную жидкость (50-80 мкл/пробирка) в 96-луночный планшет с круглым дном и выполните репортерный анализ, как описано в 3.2.
осторожность: При выбрасывании надосадочной жидкости после центрифугирования не перемешивайте гибриды на дне пробирки.
заметка: Центрифугирование на этапе 1.3.4 очень важно для удаления неинтернализованных гибридов наночастиц из питательной среды и позволяет избежать интерференции гибридов с колориметрическими/люминесцентными показаниями. Это связано с тем, что наночастицы золота могут поглощать свет на широких длинах волн в зависимости от их размера и агломерации.
2. Проверка тормозящего эффекта потенциальных кандидатов
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить ингибирующий эффект потенциальных кандидатов из скрининга, используются два подхода. Один из них заключается в изучении дозовых реакций стимуляторов (ЛПС) при фиксированной гибридной концентрации (или наоборот); другой заключается в непосредственном рассмотрении ингибирования сигналов NF-κB/AP-1 и IRF3 с помощью иммуноблоттинга.
- В первом подходе проводят репортерный анализ со 100 нМ свинцовых гибридов и двумя концентрациями ЛПС в концентрациях 1 нг/мл и 10 нг/мл, следуя тем же процедурам, которые описаны в 1.3. Включите неактивный гибрид (на основе результатов скрининга) в качестве гибридного контроля для сравнения.
- Для подхода иммуноблоттинга необходимо следовать стандартным экспериментальным процедурам.
- Культивируйте клетки THP-1 в среде R10, засеивайте клетки в 12-луночный культуральный планшет (2 x 106 клеток/лунку) и дифференцируйте их в макрофаги, обрабатывая клетки 50 нг/мл PMA в течение 24 ч с последующим отдыхом в течение 2 дней.
- После дифференцировки клеток стимулируйте клетки 10 нг/мл ЛПС с гибридами или без них (100 нМ) в течение определенного периода времени (до 4 ч). В различные моменты времени (0, 5, 15, 30, 60, 120 и 240 мин) подготовьте лизаты клеток к иммуноблоттингу. Включите неактивный гибрид в качестве элемента управления.
- Зондируйте сигналы IκBα, фосфорилированного p65 и фосфорилированного IRF3 для изучения ингибирующего влияния свинцовых гибридов на активацию NF-κB и IRF3. Зондируйте сигналы β-актина и общего IRF3 в качестве внутреннего контроля.
заметка: Передача сигнала часто происходит значительно быстрее (за несколько часов), чем экспрессия репортерных ферментов SEAP и люциферазы (24 ч). Настоятельно рекомендуется также провести анализ жизнеспособности тестируемых гибридов через 24 часа в качестве еще одного метода валидации.
3. Оценка специфичности TLR
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования специфичности TLR гибрида ведущего пептида и GNP тестируются другие сигнальные пути TLR, включая TLR2, TLR3 и TLR5. TLR7, 8 и 9 исключены, потому что макрофаги, полученные из THP-1, плохо реагируют на стимуляцию этих TLR из-за отсутствия экспрессии TLR7, 8 и 9 в макрофагах.
- Испытайте различные концентрации (от 1 нг/мл до 25 г/мл) лигандов, специфичных к TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I:C) и TLR5 (флагеллин) на обоих макрофагах, полученных из репортерных клеток, чтобы получить оптимальную концентрацию после той же процедуры в 1.1 и 1.2.
- Обрабатывают клетки смесями свинцового гибрида (100 нМ) и каждого TLR лиганда в концентрации, полученной из 3.1, для оценки ингибирующей специфичности свинцового гибрида в соответствии с экспериментальной методикой, описанной в 1.3. Включите неактивный гибрид в качестве контроля для сравнения.
