Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение органов
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус не стабилен при комнатной температуре (RT), поэтому количество животных, собранных за один раз, должно быть тщательно спланировано, чтобы сохранить титры вируса.
- Заражайте мышей в выбранной дозе и путем в зависимости от требуемого фенотипа. Для этого протокола следует инфицировать 8-10-недельных самцов и самок мышей I типа с дефицитом рецептора интерферона I типа (Ifnar1-/-) C57BL/6.
- Обезболите мышей Ифнар1-/- коктейлем из кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Проверьте педальный рефлекс сильным щипцом пальца ноги для подтверждения анестезии. Введите 1 x 105 фокусных образующих единиц (БОЕ) ZIKV в 50 мкл подкожно (СК) через подушечку лапы.
- Подготовьте все материалы, необходимые для сбора урожая, за день до этого 2 ножницы, щипцы и 20 мл 70% этанола (EtOH) в конической форме объемом 50 мл для дезинфекции инструментов.
- Подготовьте шприцы и иглы: шприц объемом 20 мл для перфузии, иглы 23 г (примерно по 1 на клетку) и шприц объемом 1 мл с иглами 25 г (1 на 3-5 мышей). Перед взвешиванием пробирок добавьте стальные шарики (в колпак) в пробирки с завинчивающейся крышкой с уплотнительным кольцом объемом 1,5 мл (по одной на каждый орган). Трубки должны быть пригодны для гомогенизации.
- Подготовьте в день сбора урожая материалы, необходимые для перфузии и замораживания органов.
- Наполните ведро со льдом сухим льдом и 70% EtOH, чтобы сделать ледяную ванну. Готовят стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS), предполагая, что на каждую мышь PBS необходимо 25-30 мл PBS на каждую перфузию (5-10 мл на спинной мозг). Получите анестезию, коктейль из кетамина и ксилазина, и примите 300 μл на каждую мышь. Поместите все материалы и любые дополнительные пробирки, необходимые для проточной цитометрии и т. д., во вторичный контейнер для транспортировки в помещение для животных.
- Соблюдайте все необходимые процедуры для входа, включая надевание и снятие средств индивидуальной защиты во время входа и выхода из помещения для животных.
осторожность: Все процедуры должны выполняться в сертифицированном шкафу биобезопасности в лабораторном учреждении уровня биобезопасности 2 (BSL-2).
- Вводите анестезию, 200-500 μл, внутрибрюшинно в зависимости от размера и веса животного. Если вы работаете в одиночку, вводите анестезию одному животному за раз, чтобы избежать убийства животных до извлечения органов.
- Подтвердите дозу анестезии, зажав палец ноги щипцами, чтобы оценить рефлекс педали. Не продолжайте, если вы полностью не реагируете. С помощью булавок закрепите мышь на восковой доске. На этом этапе окуните мышь в 70% этанол, чтобы избежать загрязнения волос во время процедуры извлечения органов.
- Неизлечимое кровотечение при пункции сердца.
- С помощью ножниц и щипцов вскройте животное через грудную полость, чтобы обнажить сердце. Соберите кровь с помощью пункции сердца (~800 μл), его можно использовать для нескольких анализов, включая клиническую химию, гематологию, проточную цитометрию для выявления антиген-специфических реакций и количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) для анализа числа вирусных копий.
- Для анализа вирусной РНК методом qRT-PCR следует собрать кровь в пробирку ЭДТА при экстракции из цельной крови или в микроцентрифужную пробирку при экстракции из сыворотки. (Для сыворотки раскрутите пробирку на максимальной скорости в центрифуге, комнатной температуры, в течение 20 минут, и удалите сыворотку в отдельную пробирку). Добавьте линейный полиакриламид в качестве носителя в образец сыворотки после завершения. Затем РНК может быть проанализирована или сохранена при температуре -80 °C для дальнейшей обработки в более поздние сроки.
- Наполните шприц объемом 20 мл PBS при комнатной температуре (или 37 °C) и перфузируйте мышей, вставив иглу-бабочку в левый желудочек. Проколите правое предсердие, чтобы кровь и PBS вышли. Медленно вводите PBS, проверяя цвет печени, чтобы убедиться, что животное полностью перфузировано. Печень должна измениться с насыщенно-красного на розово-лососевый цвет.
- При подготовке органов к гистологии оставьте иглу-бабочку на месте, а затем перфузируйте 20 мл ледяного 4% параформальдегида. Если это так, то удобно подсоединить шприц к 3-ходовому запорному крану с прикрепленными к нему обоими шприцами, включая и выключая клапан при чередовании PBS и PFA.
- Собирайте органы в помеченные, взвешенные пробирки. Для периферических органов следует соблюдать установленный порядок забора: печени, селезенки, почек и легких.
- Берут только одну долю печени, не важно, какую, но для всех экспериментов всегда старайтесь брать одну и ту же долю с кусочком одинакового размера. Аналогично для почек и легких берут те же почки и легкие. Если также необходимо завершить проточную цитометрию, любой орган может быть разрезан пополам. Храните половину, предназначенную для цитометрии, в среде Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) при комнатной температуре до завершения сбора урожая.
- Сразу после сбора поместите каждый орган в пробирку с этикеткой и поместите ее в ванну с сухим льдом. Титр вируса со временем снижается при комнатной температуре, поэтому количество времени, необходимое для забора органов, чрезвычайно важно. Между мышами должна быть согласованность, поэтому после безопасности следующим приоритетом является скорость.
заметка: При заборе органов для вирусных титров очень полезно, чтобы второй человек собрал мозг на этом этапе, чтобы сохранить вирусные титры.
- Удалите оставшиеся органы из полости тела мыши, чтобы получить доступ к позвоночнику и черепу.
- Снимите мышь с доски и снимите шкуру, после чего удалите руки и ноги.
Удалите голову мыши с помощью обезглавливающих, тупых или хирургических ножниц, чтобы извлечь мозг, разрезав череп зубчатыми ножницами Лагранжа через большое затылочное отверстие. Затем отклейте череп щипцами и вычерпните мозг с помощью шпателя.
- С помощью крепких тупых ножниц удалите ребра и другие кости, окружающие позвоночник. Затем разрежьте поперек тазовой кости, обнажив позвоночное отверстие на уровне поясницы. В этом месте должен быть виден маленький кончик спинного мозга.
- Используйте шприц объемом 10 мл, наполненный PBS, и иглу 18 G, чтобы вывести спинной мозг путем «промывания» спинного мозга от поясничного к шейному отделу позвоночника через чашку Петри.
- Осторожно поместите скошенный кончик иглы внутрь позвоночного отверстия, избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить проникновение иглы в тело позвонка. Крепко удерживайте, чтобы оказать давление на тело позвонка и иглу, и нажмите на поршень шприца, чтобы вытолкнуть спинной мозг. Немедленно перенесите спинной мозг в промаркированную трубку и поместите его в ванну с сухим льдом.
- Повторяйте процедуру со всеми животными до тех пор, пока не будет завершен сбор урожая. Поместите инструменты для сбора урожая в 70% этанол между животными. Сосредоточьтесь на стабильности и скорости. Промежуток времени между каждым забором органов должен оставаться постоянным, чтобы не искажать результаты вирусного титра.
- По завершении продезинфицируйте шкаф биобезопасности и все материалы перед тем, как вывезти его из помещения для животных.
- Извлеките каждую трубку из ледяной ванны и взвесьте трубки, чтобы определить массу органа. Чтобы определить вес органов, вычтите вес пустой трубки из веса трубки, содержащей орган.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе органы могут быть заморожены при температуре -80 °C для дальнейшей обработки в более поздние сроки или органы могут быть гомогенизированы непосредственно перед замораживанием отдельных аликвот. Замораживание-размораживание образцов в несколько раз снижает титр вируса. Поэтому важно проделать одну и ту же процедуру для всех экспериментов в рамках одного проекта.
2. Гомогенизация органов
- Подготовьте 3 помеченные пробирки объемом 1,5 мл с защелкивающимися крышками для каждого органа, подлежащего гомогенизации.
- Если образцы не гомогенизируются сразу после сбора, удалите пробирки при температуре -80 °C. Образцы не нужно размораживать для гомогенизации.
- Положите образцы на лед, чтобы они оставались холодными, чтобы свести к минимуму потерю титров вируса. Затем добавьте 1 мл холодной DMEM, содержащей 5% FBS, в каждую органосодержащую пробирку.
- Сразу же вбейте трубочки в венчик для бусин в соответствии с инструкцией производителя. Гомогенизируйте все органы стальными шариками в инструменте-гомогенизаторе. Убедитесь, что каждый орган полностью гомогенизирован.
- Раскрутите обломки органов в микрофуге при давлении 12 000 x g в течение 5 минут в микрофуге, охлажденном до 8 °C. Затем верните трубочки в ведро со льдом. В шкафу биобезопасности распределите образцы по пробиркам для проведения необходимых анализов. Затем верните трубочки в ведро со льдом.
- Для анализа формирования фокуса аликвоту 500 мкл в пробирку с этикеткой. Затем поместите трубки в решетку на ведро со льдом. Аликвота 50 мкл в пробирку для РНК для проведения флюорогенной количественной ОТ-ПЦР (qRT-PCR) для измерения числа копий вирусного генома.
- Выделите общую РНК из органов инфицированных животных с помощью коммерческого набора для выделения РНК. Определение РНК вируса флавивируса с помощью наборов праймер-зондов, специфичных для вируса ZIKV, который распознает уникальные последовательности в геноме каждого флавивируса. Определение числа вирусных копий с помощью контрольной плазмиды, содержащей определенную положительную одноцепочечную РНК, сгенерированную in vitro с использованием Т7-полимеразы, содержащей последовательности-мишени ZIKV.
- Возьмите оставшуюся пробу, которая составляет примерно 300 мкл, в третью пробирку и при необходимости храните ее при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы ранее не были заморожены, заморозьте при температуре -80 °C. Если образцы были ранее заморожены, продолжайте анализ с образованием фокуса и/или выделение РНК перед остановкой.
3. Анализ на формирование фокуса вируса Зика
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно включить контроль отсутствия вирусов и положительный контроль. Положительный контроль представляет собой серию разведения вирусного запаса с известной концентрацией. Не все контрольные элементы должны быть на одной и той же пластине, но по мере того, как проба становится больше 5 пластин, следует добавить больше контрольных пластин и распределить их по пластинам. Следите за тем, чтобы не поцарапать монослой кончиками пипетки или энергичной промывкой. Несколько органов могут быть титрированы в один и тот же день или в разные дни. Тем не менее, отдельный орган не следует титровать в течение нескольких дней, потому что различные условия анализа могут влиять на титр вируса. Настоятельно рекомендуется запускать отдельный орган в один день.
- До дня проведения анализа подготовьте клетки и реагенты, необходимые для анализа на формирование фокуса.
- Приготовьте питательную среду, содержащую 500 мл DMEM, с 5 мл HEPES и 25 мл FBS. Перед началом анализа клетки Vero-World Health Organization (WHO) должны выращиваться в питательных средах при 37 °C, 5%CO2. Клетки Vero не должны иметь высокий пассаж или когда-либо увеличиваться более чем на 100% слияние до начала анализа.
- Приготовьте 500 мл 2% раствора метилцеллюлозы, автоклавируя стеклянную бутылку объемом 1 л с 10 г метилцеллюлозы и большую полосу для перемешивания, а также отдельную стеклянную бутылку объемом 1 л с 500 мл H2O. Если автоклавная вода остыла, разогрейте в микроволновке до тех пор, пока бутылка не станет горячей на ощупь, но не закипит.
- Аккуратно налейте теплую/горячую воду в бутылку с метилцеллюлозой, находясь в вытяжке для культуры тканей. Частично закройте бутылку крышкой и помешивайте на конфорке, пока метилцеллюлоза не окажется в растворе (1-4 часа). Аликвотируйте 2% раствор метилцеллюлозы в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. 2% метилцеллюлозу можно хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока она не понадобится.
- Приготовьте 5% раствор параформальдегида в PBS для фиксации пластин и храните его при температуре 4 °C до тех пор, пока не понадобится. Приготовьте буфер для промывки 1x focus-образующего анализа, добавив 0,05% Triton X-100 в PBS, и храните при RT. Приготовьте буфер для окрашивания 1x FFA, добавив 1 мг/мл сапонина в PBS, и храните при 4 °C до тех пор, пока не понадобится. Их можно приготовить за одну-две недели.
- Рассчитайте количество плоскодонных 96-луночных планшетов, необходимых для анализа, чтобы каждый орган был покрыт в трех экземплярах. Предусмотрите достаточное количество дополнительных лунок для положительного и отрицательного контроля.
- Вырастите достаточное количество клеток Vero в питательных средах для завершения разработанного анализа. Трипсинизируйте клетки Vero и подсчитайте их, ресуспендируя их в соотношении 1,5 x 105 клеток на мл в питательных средах. Пластинчатые клетки Vero в 96 луночных планшетах с плоским дном по 3,0 x 10 4 ячейки Vero-WHO/лунка в питательных средах путем добавления 200 μл на лунку.
- Инкубируйте планшеты при температуре 37°C при 5%CO2 в течение ночи, убедитесь, что пластины находятся на одном уровне в инкубаторе, чтобы ячейки были равномерно распределены внутри лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория выращивает клетки Vero немного по-разному; мишенью является 90-95% сливающийся монослой в каждой лунке в день проведения анализа на вирус Зика.
- Разведите образцы вируса Зика в день проведения анализа. Если образцы органов были ранее гомогенизированы, достаньте образцы из морозильной камеры при температуре -80 °C и дайте им оттаять, прежде чем помещать образцы на лед для анализа.
- На льду подготовьте 96-луночную пластину с круглым дном, добавив 180 мкл холодной питательной среды в ряды от B до H, оставив ряд A пустым. Добавьте по 150 мкл каждого гомогенизированного образца органа в ряд А круглой нижней пластины.
- Приготовьте последовательное 10-кратное разведение каждого образца с помощью многоканальной пипетки. Разбавьте образцы в 96-луночном планшете с круглым дном, добавив 20 мкл образца в 180 мкл питательной среды, меняя кончики пипеток между каждым разведением.
- Подготовьте формовочную пластину, удалив среду из плоскодонной 96-луночной пластины, покрывающей ячейки Vero. Делайте это непосредственно перед добавлением образцов вируса, чтобы предотвратить высыхание монослоя.
- Добавьте по 100 мкл разбавления вируса в каждую лунку в планшете Vero. Добавьте образец, используя тот же набор советов, двигаясь от самой низкой к самой высокой концентрации. Скальные плиты 2-4 раза, стараясь не закручиваться.
- Инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 1-2 ч. Убедитесь, что планшеты находятся на одном уровне внутри инкубатора. Во время инкубации прогревают 2% метилцеллюлозу до РТ.
- Разведите 2% раствор метилцеллюлозы в питательных средах. Разведение должно быть в соотношении примерно 2:1 от 2% метилцеллюлозы к питательной среде. Держите его при комнатной температуре, пока не придет время использовать. Добавьте 1-2 капли/лунку (установите дозу на 125 μл) метилцеллюлозы: питательной среды в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Инкубировать 32-40 ч при 37 °C, 5% CO2. Поскольку клетки Vero у каждого человека растут немного по-разному, такие факторы, как слияние клеток и штамм вируса Зика, могут изменить время инкубации.
- Зафиксируйте клетки Vero с помощью приготовленного 5% раствора параформальдегида.
- Добавьте 50 мкл 5% параформальдегида в каждую лунку поверх слоя метилцеллюлозы в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение 60 минут при RT. Крепление может храниться в течение ночи при температуре 4 °C, но накройте пластину парапленкой, чтобы уменьшить испарение.
- Слейте накладку и фильтрующий материал с ячеек в контейнер для утилизации внутри шкафа биобезопасности. Аккуратно промойте PBS, 150 μл/лунка. Снимите PBS с пластин и снимите пластину с BSL-2.
- Повторите промывку PBS 2 раза, добавив 150 μл/лунку. Затем снимите PBS. Добавьте 150 мкл / лунку 1x промывочный буфер FFA и оставьте на 5-10 минут при RT для проникновения неподвижных клеток.
- Выявляйте инфекцию с помощью первичных антител к вирусу Зика. Получают первичное антитело 4G2 (D1-4G2-4-15) в концентрации 1 мкг/мл в буфере для окрашивания FFA. Подготовьте достаточное количество антител для всего анализа.
заметка: Держитесь подальше от лабораторных подгузников или других абсорбирующих материалов с высоким ворсом, так как волокна негативно повлияют на визуализацию очагов.
- Снимите промывочный буфер FFA с пластин. Добавьте 50 мкл/лунку первичного антитела в буфер для окрашивания FFA. Запечатайте пластины парапленкой и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C на качающейся платформе. Анализ может быть проведен с инкубацией в течение 2 ч в РТ.
- Визуализируйте инфекцию с добавлением вторичного HRP-конъюгированного антитела. Приготовьте вторичное антитело козы против мыши, меченное HRP, в концентрации 1:5000 в буфере для окрашивания FFA. Подготовьте достаточное количество антител для всего анализа.
- Промойте ячейки 3 раза с помощью буфера для мойки FFA, снимая буфер для стирки, каждый раз опуская его в раковину. Окрашивайте клетки вторичным антителом в буфере для окрашивания СЖК в дозе 50 мкл/лунка. Инкубировать 1-2 ч при RT.
- Промойте ячейки 3 раза с помощью буфера для мойки FFA, снимая буфер для стирки, каждый раз опуская его в раковину. Добавьте 50 μл/лунку субстрата Trueblue.
- Внимательно следите за пластинами, ожидая 2-15 минут, пока пятна не станут полностью очерченными, а фон минимальным. После того, как пятна станут видны, аккуратно промойте водой, используя руку, чтобы защитить монослой от силы текущей воды. Вытрите насухо на бумажные полотенца (НЕ ПОДГУЗНИКИ) и как можно скорее сделайте изображение.
- Пятна могут быть подсчитаны вручную или с помощью автоматического счетчика пятен. При ручном подсчете можно использовать препарирующий эндоскоп для визуализации.
- Для каждого образца выберите разведение с легко различимыми очагами (например, от 20 до 200 на лунку) и рассчитайте титр в фокусообразующих единицах на мл (БОЕ/мл), используя среднее значение дубликатов лунок: БОЕ/мл = (среднее количество очагов/лунка) × (коэффициент разведения) ÷ (мл посева).
