Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Забор крови и выделение тромбоцитов
- Возьмите человеческую кровь от здоровых взрослых доноров с помощью венепункции в день эксперимента с содержанием тритритритрицитрата в 3,8%. Одной пробирки крови объемом 4,5 мл достаточно для получения достаточного количества обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) для 20-25 состояний у доноров, у которых количество тромбоцитов близко к 250 x 103 на мкл.
заметка: Избегайте забора крови с помощью игл узкой толщины (менее 21 г).
- Приготовьте PRP с помощью центрифугирования при 22 °C и 140 x g в течение 12 минут с длительным тормозом. В результате образуются два отдельных слоя с эритроцитами внизу и светлым PRP наверху.
- Выделите верхний, мутный, желтый слой PRP с помощью осторожного пипетирования через наконечник пипетки, разрезанный под углом 45°, и получите количество тромбоцитов с помощью общего анализа крови (ОАК).
- При необходимости промывают тромбоциты в 1,4-пиперазинедиетансульфоновой кислоте натриевой соли (PIPES)-буферном физрастворе (150 мМ натрия хлорида, NaCl, 20 мМ PIPES) в присутствии простагландина Е1 (PGE1), и ресуспендируют в тиродовском буфере (134 мМ NaCl, 0,34 мМ динатрия гидрофосфата, Na2HPO4, 2,9 мМ хлорида калия, KCl, 1 мМ хлорида магния, MgCl2, 5 мМ глюкоза, 12 мМ бикарбонат натрия, NaHCO3, 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновая кислота, HEPES, pH 7,35) с 5 мМ глюкозой, в противном случае переходят к шагу 1,5. Следующие шаги кратко описывают стирку.
- Отрегулируйте объем PRP до 10 мл с помощью PIPES-буферного физиологического раствора и добавьте 0,6 μM PGE1.
- Центрифугируйте в течение 8 минут при давлении 1 900 x g, затем выбросьте надосадочную жидкость и дайте тромбоцитарной грануле постоять в 400 μл раствора Tyrode's и глюкозы в течение 5 минут.
- Аккуратно суспендируйте тромбоцитарную гранулу и держите ее в покое в течение 30 минут.
- Отрегулируйте количество тромбоцитов до ~250 x 103 тромбоцитов на мкл с помощью объединенной плазмы крови человека, бедной тромбоцитами (PPP), и поддерживайте температуру суспензии при температуре 22 °C в спокойном состоянии или при плавном вращении.
2. Антитела и равномерное лечение сдвигом
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в разделе 2, требующие пипетирования, должны выполняться медленно, чтобы не вызвать сдвиг
.
- Добавьте желаемое антитело к PRP или промытым тромбоцитам и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз или помешивая наконечником пипетки. Оставьте в покое при комнатной температуре на 5-10 минут. Добавьте эквивалентный объем PPP или буфер Tyrode к отрицательному контролю.
- Включите вискозиметр с конусной пластиной, установите температуру пластины на 22 °C и дайте время пластине достичь этой температуры.
- Пипетируйте обработанные PRP или промытые тромбоциты на вискозиметр с регулируемой температурой и конусной пластиной непосредственно в центре пластины. Убедитесь, что весь образец находится между конусом и пластиной в точке контакта, а не на внешней стороне края конуса.
- Ножницы с подходящей скоростью и продолжительностью.
- Рассчитайте сдвиг в соответствии с инструкцией по вискозиметру или как показано ранее.
- Определение скорости сдвига по вязкости и желаемому напряжению сдвига с помощью закона вязкости Ньютона;
; вязкость плазмы составляет 1,5-1,6 сантипуаз (cP). Например, нормальный диапазон сдвига для циркуляции у человека составляет 5-30 дин/см2, и сдвиг следует применять на минутной шкале с однозначным числом.
- Слегка приподнимите конус от планшета (~ 2 мм) так, чтобы образец оставался в контакте как с планшетом, так и с конусом, и используйте гелеобразный или другой длинный наконечник для пипетки, чтобы собрать 5-10 μл от центра объема образца.
- Инкубируйте срезанные образцы с нужными маркерами в течение 20 минут при комнатной температуре. Для определения маркеров воздействия фосфатидилсерина, β-галактозы и Р-селектина используйте домен С2 лактадерина (LactC2) в дозе 0,08 мкМ, лектин Erythrina cristagalli (ECL) в концентрации 6,25 мкг/мл и антитела против P-селектина (20 мкг/мл) соответственно.
- Зафиксируйте образцы в 2% параформальдегиде в течение 20 мин при RT перед разбавлением или хранением в холодильнике и перейдите к шагу 3.1 или храните образцы при температуре 4 °C не более 12 часов.
3. Обнаружение поверхностных маркеров и сшивание с помощью проточной цитометрии
- Проанализируйте образец с помощью проточной цитометрии, собрав не менее 20 000 событий для каждого состояния.
- Количественно оцените мощность сигнала флуоресцентных маркеров, используя значение высоты для интенсивности каждого флуорофора или среднюю геометрическую интенсивность флуоресценции (MFI).
- Если вы хотите обнаружить сшивку тромбоцитов после обработки сдвигом, проанализируйте образец на проточном цитометре с возможностью визуализации и количественно оцените сшивку по параметрам площади и соотношения сторон.
- Постройте гистограмму площади и/или соотношения сторон.
- Используйте отрицательный контроль с бычьим сывороточным альбумином (БСА) или транспортное средство, чтобы нарисовать ворота, исключая большинство полностью круговых событий (эти затворы обычно рисуются с соотношением сторон ~0,8) и количественно измерьте процент событий внутри этих ворот. События с более низким соотношением сторон с большей вероятностью будут связаны ссылками.
