Оценка антимикробного потенциала бактериоцинпродуцирующих изолятов фекальных бактерий мышей

Аннотация

Источник: Bäuerl, C., et al. метод оценки влияния бактериоцина на микробиоту кишечника мышей. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует обнаружение бактериоцин-продуцирующих молочнокислых бактерий, полученных из фекалий мыши. Анализ определяет антимикробную активность бактериоцина на конкретные штаммы бактерий.

Протокол

1. Лабораторный подсчет и активность бактериоцинов

1. Взвесьте по одной фекальной грануле каждого образца в пробирке объемом 1,5 мл и добавьте достаточный объем ледяного 0,9% NaCl для получения 10% (по объему) раствора. Используйте стерильные микропестики для пробирок объемом 1,5 мл для гомогенизации фекальной суспензии и готовьте десятикратные серийные разведения в ледяном 0,9% NaCl.
2. Подсчитайте общее количество ячеек LAB.
   1. Разбавленные ячейки (100 мкл) перенести в 4 мл предварительно подогретого мягкого агара Man Rogosa Sharpe (MRS) (50 °C, 0,8% агара). Перемешайте путем вортекса перед тем, как вылить клетки на твердую агаровую пластину MRS (1,5% агара).
   2. Высушите планшет, сняв крышку, в течение 5-10 минут в стерильном колпаке перед инкубацией клеток в течение 20-24 часов при 30 °C для роста клеток и образования колоний.
3. Подсчитайте клетки, продуцирующие бактериоцин.
   1. Разбавленные клетки (100 мкл) продуцента бактериоцина перенести в 4 мл предварительно нагретого мягкого агара MRS (50 °C, 0,8% агара), перемешать путем вортексирования и вылить клетки на агаровую пластину MRS (1,5% агара), этот слой называется первым слоем.
   2. Перенесите еще 4 мл бесклеточного мягкого агара MRS (0,8% агара) на первый слой, чтобы внедрить все клетки в мягкий агар.
      заметка: Этот слой предназначен для предотвращения роста клеток в виде колоний на поверхности агаровых пластин. Клетки, растущие на поверхности, легко смещаются при заливке индикаторных клеток сверху (шаг 4.3.4) и, следовательно, затрудняют интерпретацию результатов. Этот слой называется вторым слоем.
   3. Высушите планшет, сняв крышку, в течение 5-10 минут в стерильном колпаке перед инкубацией в течение 20-24 часов при 30 °C для роста клеток и образования колоний.
   4. Для выявления колоний, продуцирующих бактериоцин, смешайте 40 мкл ночной культуры соответствующего индикаторного штамма с 4 мл предварительно подогретого мягкого агара. Вылейте смесь на тарелку; Этот слой называется третьим слоем.
   5. Высушите планшет, сняв крышку в течение 5-10 минут в стерильном колпаке, а затем инкубируйте в течение 20-24 часов при 30 °C для роста клеток и образования колоний.
      заметка: Колонии, продуцирующие бактериоцин, имеют четкие (ингибирующие) зоны вокруг колоний (рис. 1).

Результаты

Рисунок 1: Обнаружение продукции бактериоцина в лаборатории, извлеченной из кала, с помощью трехслойного протокола (как описано в процедуре)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пластиковая чашка Петри	Термо Сайентиал	101ВР20
Бульон Brain-Heart-Infusion	Конда	1400
Европейский бактериологический агар	Пронадиса	1800
Агароза D1 Low EEO	Пронадиса	8010
1x буфер TAE	Термо Сайентиал	15558042
Бульон MRS	Дифко	No 288130 (Английский
Таблетки PBS	сигма	П4417-100ТАБ
шкала	Mettler Toledo	ПБ602-С

г. )