1. Гальванизация BMM на покровных стеклах для инфекции
- Подготовьте 6-луночные планшеты для культивирования тканей, поместив четыре (4) стерильных стеклянных покровных стекла толщиной 12 мм (автоклавированных и хранящихся в закрытом стеклянном контейнере) на дно каждой пустой лунки><.
заметка: Подберите каждый стерильный покровный колпак толщиной 12 мм с помощью аспирационного наконечника, установленного на вакуумной линии. Поместите покровные стекла в лунки без перекрытия, освободив их в нужном положении, зажав трубку, чтобы прервать вакуум.
- Аспиратную среду (и любые неадгезивные клетки) из чашек Петри покрыть адгезивными макрофагами, полученными из костного мозга, и аккуратно промыть адгезивные клетки 2 раза стерильным фосфатным буферным физиологическим раствором Дульбекко без хлорида кальция и магния (PBS -/-), предварительно подогретым до 37 °C.
- Добавьте по каплям 5 мл стерильного 1x PBS -/- с конечной концентрацией 1 мМ ЭДТА в каждую чашку Петри и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C для отделения адгезивных BMM. Проверьте отделение клеток с помощью микроскопа.
- Соберите все отделенные клетки, взвешенные в 1x PBS -/- с добавлением 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте каждую посуду 2 раза 5 мл PBS -/- и добавьте в бассейн с клеточной суспензией.
заметка: Клеточную суспензию можно разбавлять дополнительным PBS -/- для защиты макрофагов от токсичности ЭДТА в процессе сбора.
- Центрифугировать при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать макрофаги в среде 5 - 10 мл BMM с помощью пипетирования. Поместите ресуспендированные клетки на лед, чтобы предотвратить прикрепление к трубкам и слипание.
- Подсчет жизнеспособных клеток с помощью исключения трипанового синего в гемоцитометре.
заметка: Для подсчета BMM-клеток, ресуспендированных в среде с концентрацией 5 мл, смесь разбавления из суспензии клеток 25 мкл в PBS 445 мкл -/- и 30 мкл 0,4% раствора трипанового синего обычно позволяет легко количественно определить с помощью гемоцитометра (с учетом 20-кратного коэффициента разбавления для окончательного расчета). Учитывайте только те клетки, которые не были окрашены трипановым синим (жизнеспособные клетки). Объем клеточной суспензии может быть изменен, если эта смесь слишком концентрирована или разбавлена. В целом, выход BMM на один препарат колеблется от 2 x 107 до 5 x 107 клеток от одной мыши.
- Приготовьте клеточную суспензию в среде BMM с желаемой концентрацией покрытия (5 x 105/мл) и диспергируйте суспензию на 6 луночных планшетах в среде по 2 мл на лунку так, чтобы каждая лунка получила 1 x 106 макрофагов><.
заметка: Это критически важный шаг, который гарантирует, что каждая скважина получит достаточное количество макрофагов для равномерного покрытия покровных стеблей. Убедитесь, что покровные стекла в скважинах не перекрываются и не плавают в среде. Если это так, аккуратно отрегулируйте с помощью стерильного наконечника для дозатора.
- Инкубировать в течение ночи при 37 °C, 5%CO2.
2. Очищение от инфекционных форм L. amazonensis
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте Leishmania к инфекциям - очистите метациклические промастиготы от неподвижных культур промастиготы или дифференцируйте промастиготы в культуре в форму амастигота, используя стандартный протокол аксенической дифференцировки L. amazonensis.
- Очистка метациклических промастигот Leishmania с использованием градиентных сред плотности (Материалы)
- Приготовьте 40% исходный раствор градиентной среды в стерильной воде, не содержащей эндотоксинов.
- Раствор градиента плотности развести в 10 раз в среде М199 (без сыворотки) до получения 10% концентрации в среде М199.
- Фильтруйте все растворы через фильтр 0,22 мкм.
заметка: Стоковые растворы можно хранить при температуре 4 °C в темноте не более 1 месяца.
- Добавьте 2 мл раствора градиентной среды 40% плотности на дно конической центрифужной пробирки объемом 15 мл.
Аккуратно нанесите - слой 2 мл раствора градиента плотности 10% в M199 поверх слоя фильтрующего материала с градиентом плотности 40%, используя пипетку Пастера, чтобы избежать смешивания между двумя слоями.
- Соберите 1 x 109 паразитов из стационарной фазовой культуры центрифугированием при 1900 x g в течение 10 минут.
- Ресуспендируйте клетки в модифицированной эфирной среде Dulbecco (DMEM) объемом 6 мл.
- Нанесите слой 2 мл клеточной суспензии непосредственно поверх слоя среды с градиентом плотности 10%, осторожно, используя пипетку Пастера, чтобы избежать смешивания между слоями.
- Центрифугируйте градиент в течение 10 мин при 1 300 x g при комнатной температуре.
заметка: Из-за различий в физических свойствах между видами Leishmania условия центрифугирования для каждого из них, возможно, придется немного скорректировать, чтобы обеспечить максимальный выход.
- Соберите паразитов (обогащенных метациклической промастиготной формой) из полосы, образованной на верхней границе среды с градиентом плотности 10% (граница раздела между слоями среды с градиентом плотности 0% и 10%).
- Разбавьте паразитов одним объемом DMEM и соберите центрифугированием (1900 x g в течение 10 мин при комнатной температуре).
- Ресуспендируйте в среде 500 мкл DMEM и подсчитайте в гемоцитометре для количественной оценки выхода.
- Генерация амастигот L. amazonensis в условиях аксенического культивирования (низкий pH / повышенная температура).
- Смешать 5 мл логарифмической культуры промастиготы (рН 7,4 при 26 °С) с равным объемом среды амастигота (рН 4,5) с помощью 2 колб по 25 см (всего 10 мл среды) и инкубировать при 26 °С в течение ночи.
- Сдвиньте колбу с 26 °C на 32 °C.
- Через 3 или 4 дня расщепите культуру в соотношении 1:5 в среде амастигота при температуре 32 °C.
- Проверьте наличие паразитов в течение следующих 3 - 4 дней (максимум 7 дней), чтобы убедиться, что они готовы к использованию при инфекциях.
заметка: Здоровые аксенические амастиготы должны иметь овальную форму, без видимых жгутиков. Частично дифференцированные амастиготы имеют крупную овальную форму с короткими жгутиками. На культуре не должно быть много куртин – большое количество куртинок является признаком нерастущих, погибающих паразитов. Культуру амастигота можно разделить в соотношении 1:5 и поддерживать не более 3 недель.
3. Заражение L. amazonensis
- Разбавляют суспензии паразитов в соответствии с желаемым MOI (обычно 3-5 метациклических промастигот на макрофаг [MOI 1:3 или 1:5] и 1 амастигота на макрофаг [MOI 1:1]). Добавить Leishmania in PBS -/- в объеме 50 - 100 мкл в каждую лунку, уже содержащую 2 мл среды.
- Инкубируйте ВММ в течение 1 ч с амастиготами и 3 ч с метациклическими промастиготами при 34 °C для инфекции.
заметка: Оптимальная температура заражения может варьироваться в зависимости от вида.
- После инкубации тщательно смойте свободных паразитов в каждой лунке 3 раза по 2 мл PBS -/- предварительно подогретого до 37 °C.
заметка: Аккуратно распыляйте PBS, чтобы покровные стекла не плавали друг над другом. Аккуратно взболтайте пластину, а затем отасуньте жидкость. Используйте отдельные аспирационные наконечники при использовании нескольких штаммов паразитов, чтобы избежать перекрестного заражения.
- Зафиксируйте пробы через 1 ч или 3 ч, инкубируя каждую лунку с 1,5 - 2 мл 2% PFA в PBS -/- в течение 10 мин. Промойте 3 раза PBS -/-. Не отсасывайте последнюю стирку и охлаждайте пластины, содержащие покровные стекла, в PBS до окрашивания.
- Добавьте 2 мл свежей среды BMM в каждую лунку на планшетах для дальнейших временных точек и инкубируйте при 34 °C.
- Зафиксируйте оставшиеся временные точки по мере необходимости, как описано в шаге 4.3, и охладите пластины до окрашивания.
4. DAPI Окрашивание и монтаж покровного стекла
- Отсадите PBS из лунок, содержащих покровные стекла, и добавьте 1,5 мл PBS -/- с 0,1% неионогенного моющего средства. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем 3 раза промыть 2 мл PBS -/-.
- Добавьте 1 мл PBS -/- с 2 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (разведенного из 5 мг/мл исходного раствора в воде) в лунки, содержащие покровные стекла, и инкубируйте еще 1 ч при комнатной температуре.
заметка: Время инкубации с DAPI имеет решающее значение для правильной визуализации внутриклеточных паразитов Leishmania. Ядра макрофагов окрашиваются быстро, что обусловлено их большим размером и содержанием ДНК, но окрашивание ядер внутриклеточных паразитов происходит медленнее. Таким образом, увеличение времени инкубации сверх того, что требуется для визуализации ядер BMM, необходимо для того, чтобы DAPI мог проникать через плазматическую мембрану паразита и ядерную мембрану паразита. При правильном окрашивании DAPI в дополнение к ядерной ДНК также может быть визуализирована ДНК митохондриальных кинетопластов вблизи жгутикового кармана паразита.
- Промойте каждую лунку, содержащую покровные стекла, 3 раза 2 мл PBS -/- и затем поднимите и переверните покровные стекла с помощью щипцов, чтобы положить их стороной вниз и закрепить на предметных стеклах микроскопа с помощью имеющегося в продаже реагента для монтажа, предотвращающего выцветание.
заметка: Покровные стекла чрезвычайно хрупкие и требуют осторожного обращения. Избегайте давления на них, особенно на боковую стенку колодцев при подъеме. Добавление нескольких капель PBS -/- снижает поверхностное натяжение между покровным стеклом и колодцем и облегчает процесс подъема. Игла тонкого калибра может быть использована для извлечения покровных стекол со дна скважины. После установки покровного стекла на ползунок осторожно надавите щипцами, чтобы вытолкнуть пузырьки воздуха из монтажного материала. Если покровное стекло сломано или могло перевернуться в процессе подъема, не устанавливайте его обратно; Просто используйте запасной четвертый покровный лист.
- Охладите предметные стекла до количественного определения.
5. Количественная оценка инфекции
- Исследуйте окрашенные DAPI стекла под флуоресцентным микроскопом, фокусируясь на макрофагах с помощью объектива 100X с иммерсионным маслом (возбуждение при 358 нм; оптимальное излучение при 461 нм).
Убедитесь, что в центре внимания находится слой макрофагов между предметным стеклом и покровным стеклом.
- Количественно определите количество макрофагов (больших ядер, окрашенных DAPI) и количество более мелких ядер амастиготов, сгруппированных вокруг каждого ядра макрофага (см. рисунок 1A, DAPI) для каждого поля зрения, используя ручной счетчик.
заметка: Ядра амастиготы могут быть видны не все в одной плоскости фокуса из-за их небольшого размера. Подсчитайте те, которые видны при фокусировке на ядрах макрофагов, а затем используйте тонкую фокусировку для проверки ядер паразитов в плоскостях выше и ниже ядер макрофагов.
- Перейдите в другое поле зрения, чтобы повторить количественную оценку. Используйте отдельный ключ счетчика для отслеживания количества подсчитанных полей. Перемещайтесь по полям видимости параллельными рядами на каждом покровном листе, чтобы предотвратить наложение подсчета.
- Количественное определение не менее 200 макрофагов на одну защитную ленту. Количественно оценивайте каждую временную точку инфекции в трех экземплярах (3 покровных листа). Засчитывайте четвертый покров, если один из предыдущих не подходит для подсчета из-за перекрытия покровного стекла, плохого крепления, разбития стекла и т.д.
заметка: Если 200 макрофагов не могут быть сосчитаны ни на одном покровном листе, посчитайте запасной четвертый.
- Рассчитайте коэффициенты инфицирования в виде амастигот/макрофагов или амастигот/100 макрофагов и определите процент инфицированных макрофагов на основе исходных количественных данных.
