$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка бактерий
ПРИМЕЧАНИЕ: Цельноклеточные бактериальные субстраты и очищенные пептидогликаны используются в качестве ферментных субстратов как в анализе диффузии микрослайдов, так и в анализе высвобождения красителя. Эти субстраты требуют подготовки перед проведением ферментативных реакций. В следующем протоколе описана их подготовка.
- Субстрат для цельных бактериальных клеток
- Получить бактериальный клеточный субстрат путем инокуляции 500 мл питательного бульона культурой Bacillus subtilis 168 объемом 2 мл на ночь (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Инкубировать при температуре 30 °C с встряхиванием (125 об/мин) до тех пор, пока культура не достигнет экспоненциальной фазы роста, определяемой как фаза быстрого роста, приводящая к удвоению бактериальной культуры. Для выращивания Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708) используйте питательный бульон в качестве питательной среды при температуре 37 °C с встряхиванием (125 об/мин).
- Убейте каждую культуру путем автоклавирования в течение 10 минут при 121 °C под давлением 3 атм.
- Соберите убитый при нагревании бактериальный субстрат центрифугированием в течение 20 минут при давлении 5 000 x г. Промойте гранулу три раза водой типа 1 и повторно суспендируйте в минимальном количестве воды. В этом исследовании суспендирование субстратов в 1 200 μл.
- Аликвот 300 мкл субстратов бактериальных клеток в микрофуговые пробирки объемом 1,5 мл и хранить при температуре 20 °С.
2. Маркировка подложки - Маркировка красителя Remazol Brilliant Blue R
ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе высвобождения красителя субстрат ковалентно связан с красителем Remazol brilliant blue R. В следующем протоколе описан процесс приготовления окрашенных ферментных субстратов.
- Приготовьте 250 мМ раствор гидроксида натрия (NaOH), растворив 1 г NaOH в 99 мл воды типа I, который будет использоваться для приготовления 200 мМ раствора красителя Remazol brilliant blue R (RBB).
- Приготовьте 200 мМ раствор RBB, растворив 1,25 г RBB в 98,75 мл ± 1 мл свежего 250 мМ раствора NaOH.
- Повторно суспендировать убитые теплом бактериальные клетки в концентрации 0,5 г сырой массы в 30 мл раствора RBB. Для очищенного пептидогликана повторно суспендировать пептидогликан в концентрации 0,3 г сырой массы в 30 мл раствора RBB.
- Инкубируйте реакционную смесь в колбе Эрленмейера на вращающейся платформе в течение 6 часов при температуре 37 °C с бережным перемешиванием.
- Перенесите реакционную смесь в инкубатор с температурой 4 °C и инкубируйте еще 12 часов при бережном перемешивании.
- После инкубации соберите окрашенный субстрат центрифугированием при давлении 3 000 x g в течение 30 мин. Сцедите раствор красителя из гранул субстрата.
- Удалите нековалентно связанный растворимый краситель с подложек путем многократной промывки меченых красителем клеток или пептидогликана водой типа I с последующим центрифугированием. При каждом добавлении воды повторно тщательно суспендируйте гранулу.
заметка: В несвязанном состоянии растворимый краситель больше не виден в воде после центрифугирования. Субстрату следует дать одну дополнительную промывку. Учтите, что субстрат останется синим, в то время как надосадочная жидкость последней смывки будет прозрачной.
- Окрашенные основания хранят во взвешенном состоянии в минимальном количестве воды при температуре -20 °C для последующего использования.
3. Количественный анализ высвобождения красителя
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа выделения красителя, гидролиз окрашенного RBB субстрата в ферментативной реакции высвобождает окрашенные продукты в надосадочную жидкость реакции. Колориметрическое измерение количества выделяемого красителя указывает на величину ферментативной активности, присутствующей в образце для данного фермента. Количественный метод позволяет сравнивать различные ферменты на субстратах и позволяет варьировать условия окружающей среды, влияющие на ферментативную реакцию (например, температура, соленость и pH). В приведенном ниже протоколе описывается подготовка и проведение анализа высвобождения красителя для количественного определения ферментативной активности белковых противомикробных препаратов.
- Подготовка к анализу на высвобождение красителя
- Дать замороженному окрашенному субстрату вернуться к комнатной температуре и дважды промыть пробирным буфером (фосфатно-солевой буфер, PBS), который эмпирически определен для данного фермента.
- Рассчитайте необходимый объем субстратной суспензии, умножив объем реакции 200 мкл на количество анализов высвобождения красителя, которые необходимо выполнить.
- Суспензию субстрата готовят путем добавления окрашенной субстраты в объем буфера для анализа, определенный в 4.1.2, до достижения оптической плотности (OD) 2,0 на длине волны 595 нм с помощью спектрофотометра. Чтобы оставаться в пределах функциональных ограничений спектрофотометра, измерьте внешний диаметр 2,0595 как 1,0 для разведения концентрированного раствора в соотношении 1:1. Используйте буфер для анализа в качестве заготовки.
заметка: Мутность субстрата для реакции может быть поднята выше 2,0, чтобы соответствовать уровням активности высокоэффективных ферментов.
- Суспендировать оцениваемый белковый антимикробный препарат в буфере для анализа в расчетной концентрации 1 мг/мл.
- Используя микропланшетный анализ набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с протоколом производителя, определите фактическую концентрацию образца белка, подлежащего анализу. Отрегулируйте концентрацию исходной суспензии до 1 мг/мл с помощью пробирного буфера.
- Использование анализа высвобождения красителя для определения оптимальных условий инкубации белкового противомикробного препарата
- Разведите стоковый белок антимикробной суспензии до 100 нг/мкл. Эта концентрация дает конечную реакционную массу 1 мкг белка на объем (10 мкл), добавленного в реакцию анализа.
- Определите температурный диапазон, который необходимо оценить для бактериолитического белка. Тепловой диапазон в этих анализах включал 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C и 65 °C.
- Анализы реакции проводят в микропробирках объемом 0,5 мл. Для каждого термического условия добавьте 10 мкл исходного белка в 200 мкл приготовленной субстратной суспензии.
- Инкубировать в термоамплификаторе в течение 8 ч с перемешиванием методом инверсии один раз в час.
- После инкубации остановите реакции, добавив 25 мкл этанола.
- Удалите непереваренный, нерастворимый субстрат центрифугированием при температуре 3000 x g в течение 2 мин и перенесите 150 мкл надосадочной жидкости для каждой реакционной смеси на 96-луночный микропланшет с плоским дном, стараясь не разрушить гранулу непереваренного субстрата.
- Измерьте ферментативную активность белка-антимикробного для данного субстрата путем определения количества растворимого красителя RBB, диссоциированного от субстрата после ферментативного гидролиза. Чтобы количественно оценить ферментативную активность, измерьте поглощение надосадочной жидкости на длине волны 595 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра. Повышенная абсорбция растворимым красителем, выделяемым в надосадочную жидкость из меченого субстрата, является количественным измерением ферментативной активности.
заметка: Изменение абсорбции представлено единицами активности (AU), где 1 AU приводит к увеличению оптической плотности супернатанта реакции высвобождения красителя на 0,01 на длине волны 595 нм. Холостая реакция, инкубированная со всеми компонентами реакции, кроме фермента, используется для вычитания любого красителя, который выделяется из субстрата, меченного RBB, в результате инкубации. Оптимальная ферментативная температура обеспечивает единицу измерения пиковой активности.