Анализ с помощью точечной пластины для оценки реакций на окислительный стресс у штаммов бактерий

Аннотация

Источник: Ketelboeter, L. M. et al., Методы ингибирования бактериальной продукции пиомеланина и определения соответствующего повышения чувствительности к окислительному стрессу. J. vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует анализ пятенчатой пластины, предназначенный для оценки реакций бактериальных штаммов на окислительный стресс. Некоторые штаммы вырабатывают пиомеланин, антиоксидантный пигмент. И наоборот, штаммы, обработанные тест-агентом, что приводит к снижению выработки пиомеланина, проявляют повышенную восприимчивость к окислительному стрессу, что приводит к снижению жизнеспособности клеток по сравнению со штаммами, продуцирующими пиомеланин.

Протокол

1. Приготовление питательных сред, антибиотиков и 2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександиона (NTBC)

1. Приготовьте бульон Лурия-Бертани (LB) (1% триптон, 0,5% экстракт дрожжей, 0,25% хлорида натрия, NaCl в H₂O) и аликвоту в соответствующих объемах. Стерилизовать автоклавом. Хранить при комнатной температуре.
2. Внесите 100 мл LB агара (1% триптон, 0,5% экстракт дрожжей, 0,25% NaCl, 1,5% агар в H₂O) в колбах по 250 мл. Стерилизовать автоклавом и хранить при комнатной температуре. Убедитесь, что агар расплавился перед разливанием по тарелкам.<бр /> заметка: Из колб, содержащих 100 мл LB агара, получится 4 пластины. Количество LB-агара может быть изменено в соответствии с количеством планшетов, необходимых для анализа.
3. Изготавливают фосфатно-солевой буфер, PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ хлорида калия, KCl, 10 мМ динатрия гидрофосфата, Na₂HPO₄, 2 мМ калия дигидрофосфата, KH₂PO₄). Стерилизовать автоклавом или фильтрацией и хранить при комнатной температуре.
4. Приготовьте исходные растворы антибиотиков для гентамицина, канамицина и тобрамицина.
   1. Подготовьте соответствующие концентрации антибиотиков для штаммов Pseudomonas aeruginosa, содержащие 100 мг/мл гентамицина, 30 мг/мл канамицина и 10 мг/мл тобрамицина. Растворите антибиотики в воде, простерилизуйте фильтром (0,2 мкм) и храните при температуре 4 °C. Изменяйте антибиотики и концентрации в зависимости от изучаемой бактерии.

2. Анализ точечной пластины на реакцию на окислительный стресс

1. Установите на ночь посевы штаммов, подлежащих тестированию. Добавьте 2 мл бульона LB в 16 пробирок размером 150 мм (по одной на штамм) и заведите 1 изолированной колонией от каждого штамма. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с аэрацией на ротаторе для тканевых культур в воздушном инкубаторе.
2. Измерьте наружный диаметр₆₀₀ для ночных культур. Перед снятием показаний наружного диаметра₆₀₀ промойте посевы для устранения присутствующего в среде пиомеланина.
3. Промойте культуры, центрифугируя 1 мл культуры в микроцентрифуге при давлении 16 000 x g в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость и любые слабо гранулированные клетки с помощью микропипеттора и повторно суспендируйте твердую клеточную гранулу в 1 мл LB.
4. На следующий день приготовьте агаровые пластины LB, содержащие H₂O₂ в качестве окислительного стрессора. Диапазон концентраций_H2,_O2 от 0 до 1 мМ является хорошей отправной точкой.
   1. Растопите колбы с агаром LB. Охладите среду примерно до 50 °C при комнатной температуре.
   2. Добавьте_H2,_O2 непосредственно в охлаждаемую среду в желаемой концентрации. Перемешайте колбы, перемешайте. В таблице 1 приведены концентрации_Н2,_О2 и объемы концентрации_Н2,_О2 для добавления. Эти значения основаны на 100 мл LB агара.
   3. Сразу после добавления H₂O₂ заливайте пластины и обжигайте поверхность для удаления пузырьков. Выход составляет 4 пластины на 100 мл LB агара. Отметьте пластины концентрацией H₂O₂.
   4. Поместите незакрытые пластины в биологический проточный колпак с вентилятором, работающим в течение 30 минут, чтобы удалить лишнюю влагу с пластин.
      заметка: Используйте тарелки в тот же день, когда они будут приготовлены. Невыполнение этого требования может привести к несогласованности данных.
      заметка: Окислительные стрессоры, такие как паракват, могут быть заменены на H₂O₂ в этом анализе. Концентрации, используемые для других окислительных стрессоров, могут отличаться от концентраций, используемых дляH2O2.
5. Промойте и измерьте наружный диаметр₆₀₀ ночных культур.
6. Нормализуйте OD₆₀₀ для всех ночных культур до минимального значения для набора тестируемых штаммов. P. aeruginosa обычно имеет OD₆₀₀ примерно 2,5 при выращивании в ночное время в LB.
   1. Определите объем культуры, необходимый для разведения культуры до минимального наружного диаметра₆₀₀ в общем объеме 1 мл. Например, если культура имеет OD₆₀₀, равный 3, а самый низкий OD₆₀₀ для набора штаммов равен 2,5, выполните следующий расчет: (2,5)(1 мл) = (3)(x). x = 0,833 мл. 0,833 мл культуры помещают в пробирку с микрофугой.
   2. Рассчитайте количество LB + DMSO, необходимое для доведения объема культуры до 1 мл. Для примера на шаге 4.4.1 количество LB + ДМСО, добавленное к культуре, составит 0,167 мл (общий объем 1 мл – 0,833 мл культуры). Приготовьте стоковые растворы LB + DMSO для использования для этих разведений в зависимости от объема, необходимого для разведения всех штаммов.
   3. Смешайте культуру и LB + DMSO путем вортексирования.
7. Для поддержания культур в постоянной концентрации ДМСО выполняют десятикратные серийные разведения нормализованных ночных культур в PBS + DMSO.
   1. Сделайте стоковый раствор PBS + DMSO. Для одного набора разведений для одного штамма смешайте 300 мкМ объема ДМСО с PBS, чтобы получить общий объем 720 мкл. Масштабируйте эти акции в большую или меньшую сторону в зависимости от того, сколько штаммов тестируется.
   2. Маркировка микрофужей пробирок для серийных разведений от ^10-1 до ^10-7. Добавьте 90 мкл PBS + ДМСО в соответствующие пробирки. Используйте PBS + DMSO для штаммов, выращенных в LB + DMSO.
   3. Добавьте 10 мкл культуры в соответствующую пробирку для разведения ^10-1. Перемешайте методом вортекса и переведите 10 мкл разбавления ^10-1 в пробирку для разбавления ^10-2. Повторяйте до тех пор, пока не будут выполнены все разведения. Меняйте наконечники пипеток между разведениями.
8. Нанесите 5 мкл от ^10-3 до ^10-7 разведений на планшеты LB + H₂O₂ в двух экземплярах для каждого штамма. Используйте один наконечник для пипетки, если пятна покрыты от наиболее разбавленных до наименее разбавленных (от ^10-7 до ^10-3). Не опрокидывайте и не наклоняйте пластину, пока жидкость не высохнет в тарелке.
9. Инкубировать планшеты в течение 24-48 часов при температуре 37 °C (воздушный инкубатор), в зависимости от штамма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: P. aeruginosa PAO1 будет иметь большие колонии на LB после 24 часов инкубации. Инкубируйте штаммы до тех пор, пока у них не появятся колонии примерно такого же размера, как PAO1.
10. Сфотографируйте пластины с помощью ПЗС-камеры над транслюминатором. При желании отредактируйте фотографии для повышения контрастности и обрежьте их до одинакового размера. Подсчитайте количество колоний в каждом месте, чтобы определить изменения чувствительности к окислительному стрессу.

Таблица 1: Концентрации H₂O₂ для добавления в агар LB для анализа на пластине для пятна окислительного стресса. В этой таблице приведены различные концентрации H₂O₂ и соответствующее количество концентрированного сырья H₂O₂ для добавления в 100 мл агара LB.

См.

Конечная концентрацияH2O2 (мМ)	Количество добавления 9,79 M H2O2 (30% масс.) (μл)
0	0
0,2	2.04
0,4	4.09
0,6	6.13
0,8	8.17
1	10.21

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександион (НТБХ)	Сигма-Олдрич	SML0269-50мг	Также называется нитизиноном. Растворим в ДМСО.
Н2О2	Сигма-Олдрич	216763-100МЛ	30 мас.% в H2O. Стабильный.