Оценка эффективности тестируемого соединения против микобактерий в бульоне

Аннотация

Источник: Zheng, X., et al. Система скрининга эффективности и цитотоксичности ингибиторов, нацеленных на внутриклеточные микобактерии туберкулеза. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует анализ в бульоне для определения эффективности антибиотиков против Mycobacterium tuberculosis. Бактериальную культуру инкубируют с различными концентрациями бактерицидного антибиотика. Бактерицидная эффективность измеряется путем оценки наличия жизнеспособных бактерий с помощью анализа на резазурин.

Протокол

1. Бактериальный штамм и питательная среда

1. Приготовьте альбуминдекстрозу и раствор солевого запаса (АДС) путем солюбилизации 25 г бычьего сывороточного альбумина, 10,0 г декстрозы и 4,05 г хлорида натрия в 460 мл деионизированной воды. Простерилизуйте ADS и храните его при температуре 4 °C.
2. Приготовьте бульон 7Н9, добавив 4,7 г порошка 7Н9 и 2 мл глицерина на 900 мл очищенной воды. Отварите бульон 7H9 при температуре 121 °C в течение 10 минут и дайте ему остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Приготовьте 7H9ADST, добавив 100 мл ADS и 0,5 мл Tween80 до 900 мл бульона 7H9. Хранить при температуре 4 °C.
3. Взвесьте 50 мг канамицина сульфата и растворите его в 1 мл деионизированной воды, конечная концентрация составляет 50 мг/мл. Процедить-стерилизовать и хранить при температуре -20 °C. Добавить 0,5 мл стокового раствора канамицина на 1 л 7H9ADST.
   заметка: Эту среду следует делать свежей, поэтому масштабируйте объемы в соответствии с размером культуры.
4. Выращивают M. tuberculosis в 7H9ADST с добавлением канамицина в культуре стоя. Ежедневно встряхивайте культуру и разбавляйте ее до того, как внешний диаметр₆₀₀ достигнет 1,0, чтобы избежать комкования.
   заметка: Штамм M. tuberculosis, использованный для разработки этого метода, представлял собой H37Rv, трансформированный с помощью плазмиды pJAK2.A. pJAK2.A представляет собой интегративную плазмиду на основе вектора pMV361, которая обеспечивает высокий уровень экспрессии гена люциферазы светлячка из промотора hsp60 и может быть выбрана с помощью канамицина.

2. Анализ активности в бульоне с помощью анализа на резазурин

1. Выращивают M. tuberculosis в 7H9ADST до среднелогической фазы (~ 0,5 - 0,8 OD600). Разбавьте культуру с помощью 7H9ADST до 0,01 OD₆₀₀. Разбавьте соединения в 7H9ADST в 2 раза выше исследуемых концентраций и добавьте 100 мкл каждого разведенного соединения в каждую лунку.
2. Перелейте по 100 мкл разведенной бактериальной суспензии в каждую лунку. Дайте планшетам инкубироваться при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе в течение 5 дней. Растворите 10 мг резазурина в 100 мл деионизированной воды и стерильном фильтре.
3. Добавьте 30 μл раствора резазурина и следите за изменением цвета через 48 часов; рост бактерий проявляется преобразованием цвета из синего в розовый.
   заметка: Количественный анализ также может быть выполнен путем измерения флуоресценции на длине волны 590 нм с возбуждением на длине волны 530 - 560 нм или поглощения на длине волны 570 нм и длине волны 600 нм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Миддлбрук 7H9	Бектон, Дикинсон и компания	No 271210
Твин80	Научный центр Фишера	Т164
Альбумин, бычий pH7	Аффиметрикс	10857
глюкоза	Научный центр Фишера	БП350
Хлорид натрия	Научный центр Фишера	БП358
Канамицина сульфат	Научный центр Фишера	БП906
Ресазурин	Альфа Аэсар	В21187
глицерин	Научный центр Фишера	БП229
M. tuberculosis H37Rv
96-луночный белый планшет с плоским дном	Корнинг	No 3917
95-луночная прозрачная пластина с плоским дном	Корнинг	No 3595
Прозрачная пластинчатая запайщик	Thermo Fisher Scientific	АБ-0580
Люминометр	Прикладные биосистемы	Тропикс TR717