$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Бактериальный штамм и питательная среда
- Приготовьте альбуминдекстрозу и раствор солевого запаса (АДС) путем солюбилизации 25 г бычьего сывороточного альбумина, 10,0 г декстрозы и 4,05 г хлорида натрия в 460 мл деионизированной воды. Простерилизуйте ADS и храните его при температуре 4 °C.
- Приготовьте бульон 7Н9, добавив 4,7 г порошка 7Н9 и 2 мл глицерина на 900 мл очищенной воды. Отварите бульон 7H9 при температуре 121 °C в течение 10 минут и дайте ему остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Приготовьте 7H9ADST, добавив 100 мл ADS и 0,5 мл Tween80 до 900 мл бульона 7H9. Хранить при температуре 4 °C.
- Взвесьте 50 мг канамицина сульфата и растворите его в 1 мл деионизированной воды, конечная концентрация составляет 50 мг/мл. Процедить-стерилизовать и хранить при температуре -20 °C. Добавить 0,5 мл стокового раствора канамицина на 1 л 7H9ADST.
заметка: Эту среду следует делать свежей, поэтому масштабируйте объемы в соответствии с размером культуры.
- Выращивают M. tuberculosis в 7H9ADST с добавлением канамицина в культуре стоя. Ежедневно встряхивайте культуру и разбавляйте ее до того, как внешний диаметр600 достигнет 1,0, чтобы избежать комкования.
заметка: Штамм M. tuberculosis, использованный для разработки этого метода, представлял собой H37Rv, трансформированный с помощью плазмиды pJAK2.A. pJAK2.A представляет собой интегративную плазмиду на основе вектора pMV361, которая обеспечивает высокий уровень экспрессии гена люциферазы светлячка из промотора hsp60 и может быть выбрана с помощью канамицина.
2. Анализ активности в бульоне с помощью анализа на резазурин
- Выращивают M. tuberculosis в 7H9ADST до среднелогической фазы (~ 0,5 - 0,8 OD600). Разбавьте культуру с помощью 7H9ADST до 0,01 OD600. Разбавьте соединения в 7H9ADST в 2 раза выше исследуемых концентраций и добавьте 100 мкл каждого разведенного соединения в каждую лунку.
- Перелейте по 100 мкл разведенной бактериальной суспензии в каждую лунку. Дайте планшетам инкубироваться при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе в течение 5 дней. Растворите 10 мг резазурина в 100 мл деионизированной воды и стерильном фильтре.
- Добавьте 30 μл раствора резазурина и следите за изменением цвета через 48 часов; рост бактерий проявляется преобразованием цвета из синего в розовый.
заметка: Количественный анализ также может быть выполнен путем измерения флуоресценции на длине волны 590 нм с возбуждением на длине волны 530 - 560 нм или поглощения на длине волны 570 нм и длине волны 600 нм.