Измерение TEER в облученных рентгеновским излучением эпителиальных клетках, совместно культивируемых с PBMC

Аннотация

Источник: Babini, G., et al. метод совместного культивирования для исследования перекрестных помех между облученными рентгеновскими клетками Caco-2 и PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует измерение трансэпителиального электрического сопротивления в облученных клетках Caco-2, как в присутствии, так и в отсутствии клеток PBMC. Этот метод позволяет изучать синергетическое воздействие радиации и иммунных клеток на эпителиальный клеточный барьер.

Протокол

1. Установка для облучения

Примечание: Облучение клеток Caco-2 проводилось в отделении лучевой терапии Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Италия) с помощью линейного ускорителя, обычно используемого для лечения различных типов рака.

1. Установите энергию фотонного рентгеновского излучения равной 6 МВ пиковой. Линейный ускоритель работает в импульсном режиме (время между двумя последовательными импульсами около 4 мс; длительность одного импульса около 5 мкс, мощность дозы до 1 × ^10-3 Гр/).
2. Поместите 6-луночные планшеты, содержащие вставки с Caco-2, на траекторию рентгеновского излучения на лист оргстекла толщиной 1,4 см (что соответствует расстоянию, несколько большему, чем накопление используемого излучения) на расстоянии 100 см от источника излучения.
3. Поместите на каждый образец болюс толщиной 0,5 см перед облучением, чтобы гарантировать обратно-рассеянную составляющую излучения и равновесие заряженных частиц.
4. Облучают клетки (дозы в диапазоне 2 - 10 Гр) плоским и симметричным (± 2%) полем излучения 20 х 20_см2 и мощностью дозы 3 Гр/мин.<бр/> заметка: Контрольные "бутафорские" облученные клетки подвергались тем же процедурным условиям, что и облучаемые, не входя в облучательную комнату (полученная доза: 0 Гр).
   осторожность: Устройства, производящие ионизирующее излучение, должны использоваться только специализированным персоналом.

2. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)

1. Затравите 5 ×^{10 5} клеток Caco-2 за неделю до облучения в 6-луночные планшетные вкладыши для совместной культуры (полиэтилентерефталат (ПЭТ), 2 x 10⁶ пор/см2).
2. За 1 ч до облучения измерьте TEER с помощью вольтметра/омметра.
3. Облучайте клетки, как описано в шагах 1.1 - 1.4.
4. Инкубируют клетки Caco-2 в присутствии/отсутствии совместного культивирования с PBMC при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2.
5. В течение первых нескольких часов после облучения измеряйте TEER каждый час, а затем каждые 3 часа до 48 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вкладыши для клеточных культур ThinCert 6 лунок для многолуночных планшетов	Greiner Bio-one	657610 (Английский	оборудование
Многолуночный планшет для клеточных культур, 6 лунок	Greiner Bio-one	657160 (Английский	пластмасса
Многолуночный планшет для клеточных культур, 24 лунки	Greiner Bio-one	Номер 662160	пластмасса
RPMI 1640 без L-глютамина	Лонза	12-167Ф	Реагентов
Вольтметр/омметр Millicell-ERS	Многородность	MERS 00001	оборудование

) )