Анализ биопленки с помощью штифтовой пластины для скрининга антибактериальных агентов

Аннотация

Источник: Dalecki, A. G., et al. Нацеливание на биопленочный Staphylococcus aureus с использованием анализа чувствительности к лекарствам на основе резазурина. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует анализ для скрининга антимикробных соединений, которые эффективно уничтожают биопленки с помощью колышковой пластины. Методика позволяет контролировать метаболическое состояние биопленки после обработки антимикробными соединениями, способствуя определению минимальной концентрации для эрадикации биопленки.

Протокол

1. Инициация биопленки

1. Выращивайте культуру организмов, образующих биопленку, в среде, богатой питательными веществами. Инокулируют золотистый стафилококк штамма Ньюмана в 10 мл среды Мюллера-Хинтона из глицеринового бульона. Выполняйте все работы, связанные с обращением с S. aureus, в перчатках и в шкафу биобезопасности.
2. Инкубировать в течение 16 часов при температуре 37 °C на ротационном встряхивателе (100-200 об/мин).
3. Определяют ОД₆₀₀ культуры с помощью спектрофотометра и стандартной кюветы (длина пути: 1 см).
4. Рассчитайте объем (V) культуры, необходимый для приготовления 20 мл инокулюма с наружным диаметром_{600 (посевной материал)} 0,1 в хелексированных средах Мемориального института Розуэлл Парк (CRPMI) по формуле: [V = 20 мл * 0,1/наружный диаметр_{600 (культура)}].
   1. Добавьте рассчитанный объем культуры (см. выше) в пробирку центрифуги и ячейки для гранул путем вращения в течение 1 минуты при 10 000 x g. Для приготовления биопленочного инокулята необходимо аспирировать отработанную питательную среду и ресуспендировать клеточную гранулу в 20 мл КРПМИ.
5. Налейте инокулюм в емкость объемом 25 мл.
6. Осторожно снимите крышку со стерильной 96-луночной колышковой пластины, потянув ее прямо вверх.
   Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не загрязнить колышки, свисающие с крышки. Крышку можно поставить вверх дном на чистую поверхность в шкафу биобезопасности.
7. С помощью многоканальной пипетки объемом 200 мкл добавьте 125 мкл инокулюма в каждую лунку рядов от A до G нижней пластины.
8. Наполните 125 мкл стерильной среды CRPMI в каждую лунку ряда H для контроля стерильности.
9. Возьмите крышку с колышком и держите ее над дном тарелки колышками вниз. Тщательно выровняйте отдельные колышки с соответствующими лунками. Избегайте физического контакта между пластиной и колышками. После выравнивания осторожно опустите крышку. Избегайте перекосов, так как повторная регулировка, выполненная после того, как штифты коснулись нижней пластины, может привести к загрязнению органов контроля стерильности в ряду H.
10. Приклейте крышку к тарелке парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение, и поместите ее в герметичный полиэтиленовый пакет, плотно закрыв. Держите объем воздуха в пакете как можно меньше, чтобы свести к минимуму испарение.
11. Инкубировать без встряхивания при 37 °C в течение 48 часов в инкубаторе с 5% содержанием_CO2.
    Примечание: 48 часов роста являются оптимальными для S. aureus, но будут варьироваться в зависимости от используемого организма.
    заметка: Несмотря на то, что статическая инкубация является хорошей отправной точкой для оптимизации анализа, осторожное встряхивание со скоростью 150 об/мин на микропланшетном шейкере является возможным вариантом, который может усилить образование биопленки некоторых изолятов S. aureus.

2. Подготовка провокационной пластины Biofilm

1. В день испытания биопленки возьмите свежий 96-луночный планшет и добавьте 100 мкл CRPMI, уравновешенного по RT, в каждую лунку рядов от B до H. Чтобы избежать нестабильных результатов, используйте 96-луночный планшет, который может вмещать 200 μл среды, когда штифты находятся внутри, и имеет лунки с размерами, идентичными размерам инициирующей биопленки.
2. Разведите до 4 испытуемых соединений отдельно в 1,0 мл CRPMI до 2-кратной желаемой конечной концентрации, чтобы учесть окончательное разведение на стадии 2.7.
   Примечание: Хорошей отправной точкой является 8-кратное превышение ингибирующей концентрации планктонных клеток.
3. Добавьте 200 мкл соединения 1 в лунки от А1 до А3, соединение 2 в лунки от А4 до А6, соединение 3 в лунки от А7 до А9 и соединение 4 в лунки от А10 до А12.
4. Последовательно разбавьте испытуемые соединения с помощью многоканальной пипетки и перенесите 100 мкл из ряда А в ряд В и перемешайте.
5. Таким образом, продолжайте перекачивать 100 мкл из скважины в лунку. Перемешивайте после каждой пересадки и останавливайтесь в ряду F.
6. После смешивания вылейте 100 мкл из ряда F в контейнер для отходов. Не переливайте жидкость в ряды G и H.
7. Добавьте по 100 мкл CRPMI в каждую лунку планшета с помощью многоканальной пипетки, чтобы довести объем до 200 мкл. На рисунке 1 приведена окончательная схема расположения пластин.

3. Испытание биопленки

1. Добавьте 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в свежий стерильный 96-луночный планшет, который имеет лунки с размерами, идентичными размерам планшета для инициации биопленки.
2. Снимите полиэтиленовый пакет и парафиновую пленку с инициирующей пластины инкубированной биопленки.
3. Поднимите крышку прямо вверх. Избегайте контакта между колышками и дном пластины, так как это может повредить биопленку. Оставьте нижнюю часть для последующего анализа наружного диаметра₆₀₀ (см. 3.8).
4. Промойте планктонные клетки, поместив колышек-крышку на пластину, содержащую PBS (из шага 3.1). Погрузите колышки на 5 секунд, поднимите PBS и погрузите еще раз, стараясь не ударить колышки о стенки колодца.
5. Поместите промытую крышку с колышком в рабочую пластину. Избегайте ненужного контакта между колышками и нижней пластиной, так как это приведет к повреждению биопленки, что приведет к нестабильным результатам.
6. Запечатайте пластину парафиновой пленкой и поместите ее в герметичный пластиковый пакет, как описано в шаге 1.10.
7. Инкубировать планшет без встряхивания в течение 24 часов при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2.
8. Возьмите нижнюю часть пластины для инициации биопленки из 3.3. Ресуспендируйте бактерии в каждой лунке с помощью многоканальной пипетки и измерьте внешний диаметр₆₀₀ с помощью подходящего считывателя микропланшетов, чтобы подтвердить, что рост происходит во всех лунках, но стерильность контролируется в ряду H.

4. Определение биопленки

1. Используйте планшетный считыватель, оснащенный инкубационной камерой и способный снимать показания кинетической флуоресценции для обнаружения преобразования резазурина. Настройте 24-часовое измерение кинетической флуоресценции с использованием возбуждения 530 нм и излучения 590 нм.
2. Установите температуру камеры на 37 °C и считывайте показания пластины каждые 20 мин. Установите считыватель пластин на измерение от нижней части пластины в соответствии с инструкциями производителя.
3. Подготовьте промывочную пластину, добавив 200 мкл PBS с помощью многоканальной пипетки в стерильную 96-луночную пластину.
4. Приготовьте среду для восстановления биопленки, добавив 400 мкл 0,8 мг/мл стокового раствора резазурина к 20 мл среды CRPMI до конечной концентрации 16 мкг/мл резазурин.
   заметка: Резазурин является известным раздражителем кожи. Во время работы используйте лабораторный халат, брызговики и перчатки. В качестве среды для восстановления биопленки был использован CRPMI, поскольку она обеспечивает самый низкий фоновый сигнал, но при необходимости ее можно заменить на среду Мюллера-Хинтона.
5. Добавьте 150 мкл среды для восстановления биопленки с помощью многоканальной пипетки в каждую лунку свежего 96-луночного планшета.
6. Перенесите тестовую пластину из инкубатора в шкаф для биобезопасности и осторожно снимите полиэтиленовый пакет и герметизирующую пленку.
7. Снимите колышковую крышку с контрольной пластины и промойте планктонные клетки в PBS, как описано в 3.4. Оставьте нижнюю часть проблемной таблички для последующего анализа наружного диаметра₆₀₀ (см. 4.10).
8. После промывки поместите колышковую крышку на дно пластины, содержащее среду для восстановления биопленки.
9. Оберните боковую сторону плиты парафиновой пленкой, стараясь не загромождать дно по периметру колодцев. Сразу после упаковки планшета поместите его на считыватель планшетов и начните кинетическое считывание в течение 24 часов, инициируя ранее созданный кинетический протокол резазурина с шага 4.1.
10. Чтобы количественно оценить рост планктонных клеток, который может произойти или не произойти во время испытания, считайте наружный диаметр₆₀₀ всего дна тестовой пластины с помощью считывателя микропланшетов. Следуйте инструкциям, приведенным в шаге 3.8.
    Примечание: Осторожно ресуспендируйте содержимое каждой лунки, так как клетки, сбрасывающие биопленку, имеют тенденцию расти сгустками на дне лунки. Любые пузырьки в лунке будут сильно мешать показаниям наружного диаметра₆₀₀, и их необходимо избегать или удалять до считывания.

Результаты

Рисунок 1. Раскладка проблемной пластины. Пример схемы провокационной пластины, позволяющей проводить параллельные испытания четырех соединений в трех экземплярах при шести различных концентрациях. Также включены средства контроля необработанных и стерильности. Компоновочная конструкция обеспечивает удобную внутрипланшетную подготовку серийных разведений с помощью многоканальной пипетки. Концентрации...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Медиум Мюллера-Хинтона	Оксоидный	КМ0405	Следуйте рекомендациям производителя
RPMI-medium	Корнинг	17-105-ЛВ
ЦРПМИ	Ссылка 9		RPMI-1640 средний хелекс в течение 1 ч со смолой Chelex 100 с последующим добавлением 10% нехелексного RPMI-1640
Смола Chelex 100	Био Рад	142-2822
Плиты MBEC	Инновотех	19111 г
Резазурин Натриевая соль	сигма	Р7017	800 мкг/мл в фильтре для воды DI стерильный
Платформа для встряхивания микропластин	Хайдольф Титрамакс 1000
Считыватель планшетов Cytation 3	Биотек
Программное обеспечение Gen5	Биотек		Регистрация и анализ конверсии резазурина
Неокупроин	сигма	Н1501	Приготовьте 10 мМ бульона в 100% этаноле, храните при -80 ºC
Медный купорос	Акрос Органик	7758-99-8 (Английский)	Приготовьте стоковый раствор 100 мМ в воде, храните при температуре 4 ºC
Cu-неокупроин	Самодельный		Образуется путем смешивания равных молярностей неокупроина и сульфата меди. Смесь разводили в среде CRPMI до требуемой концентрации.
Гентамицин	сигма	Г3632-1Г

.