Флуоресцентный анализ in vitro для измерения эффективности повторного герметизации плазматической мембраны

Аннотация

Источник: Lam, J. G., et al. Высокопроизводительное измерение эффективности повторного герметизации плазматической мембраны в клетках млекопитающих. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует анализ для изучения эффективности повторного герметизации плазматической мембраны в клетках млекопитающих. Клетки подвергаются воздействию бактериального порообразующего токсина, который образует поры в клеточной мембране. В присутствии внеклеточных ионов кальция пора вызывает приток кальция, вызывая события повторного герметизации мембраны. Эффективность повторного герметизации оценивается с помощью ДНК-связывающего йодидного красителя пропидия, который проникает в клетки только без повторно запечатанной мембраны.

Протокол

1. Подготовка

1. Покрытие ячеек
   заметка: В этом протоколе использовались эпителиальные клетки шейки матки человека, HeLa и HeLa, экспрессирующие гистон 2B-GFP (H2B-GFP), но этот анализ может быть адаптирован к другим клеткам млекопитающих.
   1. Отделите адгезивные клетки от колбы для клеточных культур размером 75 см², промыв клетки 2 мл Trypsin-EDTA 0,25%. Замените использованный трипсин 2 мл свежего трипсина-ЭДТА 0,25%.
   2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 5 минут, пока ячейки не округлятся и не отделятся от колбы.
   3. Ресуспендируйте клетки в 8 мл питательной среды (D....

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. На блок-схеме изображена репрезентативная конструкция пластины, сконфигурированная для проверки эффекта семи испытательных условий по сравнению с контрольными необработанными ячейками. При необходимости следует предусмотреть дополнительные меры контроля, например, транспортные средства для приема лекарственных препаратов. Клетки покрываются гальваническим покрытие.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SpectraMax i3x Многорежимный считыватель микропланшетов	Молекулярные приборы	i3x
MiniMax 300 Цитометр для визуализации	Молекулярные приборы	5024062
ТО-ПРО-3	ThermoFisher Scientific	Т3605
Йодид пропидиума	ThermoFisher Scientific	П3566
HeLa	АТКС	CCL2
HeLa H2B-GFP	Многородность	ПКК117
Трипсин-ЭДТА 0,25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-луночная пластина с плоским дном Corning с черным полистиролом для обработки культуры тканей	Корнинг	3603
Сбалансированные соли Хэнкса	Сигма-Олдрич	Н4891
ЭГТА	МСК «БиоЭкспресс»	0732-100Г
ХЕПЕС	Научный центр Фишера	БП310-500
D-(+)-глюкоза, HybriMax	Сигма-Олдрич	Г5146-1КГ