Флуоресцентный анализ in vitro для измерения эффективности повторного герметизации плазматической мембраны

Аннотация

Источник: Lam, J. G., et al. Высокопроизводительное измерение эффективности повторного герметизации плазматической мембраны в клетках млекопитающих. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует анализ для изучения эффективности повторного герметизации плазматической мембраны в клетках млекопитающих. Клетки подвергаются воздействию бактериального порообразующего токсина, который образует поры в клеточной мембране. В присутствии внеклеточных ионов кальция пора вызывает приток кальция, вызывая события повторного герметизации мембраны. Эффективность повторного герметизации оценивается с помощью ДНК-связывающего йодидного красителя пропидия, который проникает в клетки только без повторно запечатанной мембраны.

Протокол

1. Подготовка

1. Покрытие ячеек
   заметка: В этом протоколе использовались эпителиальные клетки шейки матки человека, HeLa и HeLa, экспрессирующие гистон 2B-GFP (H2B-GFP), но этот анализ может быть адаптирован к другим клеткам млекопитающих.
   1. Отделите адгезивные клетки от колбы для клеточных культур размером 75 см², промыв клетки 2 мл Trypsin-EDTA 0,25%. Замените использованный трипсин 2 мл свежего трипсина-ЭДТА 0,25%.
   2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 5 минут, пока ячейки не округлятся и не отделятся от колбы.
   3. Ресуспендируйте клетки в 8 мл питательной среды (DMEM, содержащей 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
   4. Определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и 10 мкл клеточной суспензии.
   5. Разведите клетки в питательной среде до концентрации 2,5 x 10⁵ клеток/мл.
   6. Налейте клеточную суспензию в стерильный таз для пипетки и тщательно перемешайте суспензию с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
   7. С помощью 12-канальной микропипетки и наконечников объемом 200 мкл распределите клетки HeLa (2,5 x 10⁴ клеток/100 мкл/лунка) в трех (или четырехугольных) 96-луночных плоских планшетах с прозрачным дном, обработанным культурой тканей черного полистирола.
      заметка: Схема обшивки представлена в качестве примера на рисунке 1.
   8. Культивировать клетки в течение 24 ч в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур при 37 °C и 5%_CO2.
2. Приготовление исходного раствора
   1. Приготовьте 1 л из 10-кратного запаса буфера M (используемого для приготовления M1 и M2), добавив 95 г сбалансированного солевого раствора Hanks, 0,476 г MgCl2 (5 мМ) и 23,83 г HEPES (100 мМ) на 900 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 и увеличьте объем до 1 л. Фильтр простерилизовать.
   2. Приготовьте 50 мл 50-кратного (1,25 М) запаса глюкозы, добавив 11,26 г D-(+)-глюкозы к 50 мл воды. Процеживаем, стерилизуем раствор.
   3. Приготовьте 50 мл 100-кратного (120 мМ) запаса кальция, добавив 0,666 г CaCl₂ к 50 мл воды. Процеживаем, стерилизуем раствор.
   4. Приготовьте 50 мл 10-кратного (50 мМ) запаса этиленгликоля-биса (2-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N', тетрауксусной кислоты (EGTA), добавив 0,951 г EGTA к 40 мл воды. Увеличьте pH до 8 с помощью NaOH для растворения EGTA, затем увеличьте объем до 50 мл. Процеживаем, стерилизуем раствор.
   5. Для одного 96-луночного планшета приготовьте 50 мл среды 1 (M1, содержит Ca²⁺), 50 мл среды 2 (M2, Ca²⁺-free) и 15 мл среды 2 с добавлением EGTA, соответственно:
      1. Для M1 добавьте 5 мл 10x Buffer M, 0,5 мл 100x CaCl₂ и 1 мл 50x глюкозы на 43,5 мл воды.
      2. Для M2 добавьте 5 мл 10x Buffer M и 1 мл 50x глюкозы в 44 мл воды.
      3. Для M2/EGTA добавьте 1,5 мл 10x Buffer M и 1,5 мл 10x EGTA на 12 мл воды.
         заметка: Все растворы, содержащие йодид пропидия (ПИ), должны быть приготовлены непосредственно перед добавлением в клетки.
3. Настройки считывателя планшетов/цитометра для визуализации
   заметка: Используйте многорежимный считыватель пластин, оснащенный двумя блоками детектирования: спектрофлуориметром и изображающим цитометром. Ограничьте воздействие флуоресценции, чтобы избежать фотообесцвечивания флуорофоров.
   1. Перед проведением анализа предварительно нагрейте планшетный считыватель до 37 °C.
   2. Настройте параметры кинетического анализа соответствующим образом в режиме Настройки:
      1. Выберите монохроматор, FL (флуоресценция) и кинетический для оптической конфигурации, режимов чтения и типа чтения соответственно.
      2. В разделе Wavelength Settings (Настройки длины волны) выберите полосы возбуждения и излучения 9 и 15 нм соответственно. Для анализов с использованием йодида пропидия (PI) установите длины волн возбуждения и излучения на 535 и 617 нм соответственно.
      3. В разделе Тип пластины выберите 96 лунок для формата пластины и предустановленную конфигурацию пластины, соответствующую пластине с прозрачным дном с черными стенками.
      4. В разделе «Область чтения» выделите скважины, которые будут анализироваться на протяжении кинетики.
      5. В разделе ФЭУ и оптика установите количество вспышек на считывание равным 6 и установите флажок Чтение снизу.
      6. В разделе "Время" введите 00:30:00 в поле "Общее время выполнения" для 30-минутного кинетического анализа и введите 00:05:00 для параметра "Интервал".
         Примечание: Для каждой временной точки и одной длины волны время считывания полного 96-луночного планшета составляет 30 с.
      7. Подтвердите указанные настройки в разделе «Информация о настройках» справа и нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку «Чтение», чтобы начать кинетический пробег.
   3. Настройте параметры изображения соответствующим образом в режиме Настройки:
      1. Выберите «Минимакс», «Визуализация» и «Конечная точка» для оптической конфигурации, режимов чтения и типа чтения соответственно.
      2. В разделе Длины волн выберите проходящий свет, а также один или оба флуоресцентных блока, соответствующие длинам волн возбуждения и излучения 456/541 нм (GFP) и 625/713 нм (PI).
      3. Используйте те же параметры для типа пластины и области считывания, которые определены в шагах 1.3.2.3 и 1.3.2.4.
      4. В разделе "Настройка площади скважины" выберите количество участков в скважине для создания изображения.
         Примечание: 12 участков соответствуют изображению полной скважины.
      5. В разделе «Настройки получения изображений» выберите время экспозиции для проходящего света, 541 (GFP) и 713 (PI). Для GFP визуализируйте всю лунку со временем экспозиции 20 мс/изображение. Для проходящего света (TL) и ПИ флуоресценции необходимо получить одно изображение центра каждой лунки с временем экспозиции 8 и 20 мс соответственно.
      6. Подтвердите указанные настройки в разделе «Информация о настройках» справа и нажмите кнопку «ОК». Время получения изображений всей поверхности каждой лунки (12 изображений/лунка) 96-луночного планшета и для одной длины волны составляет ~15 минут. Нажмите «Читать», чтобы начать создание образа.
         Примечание: Время получения одного изображения/лунки 96-луночного планшета требует ~2,5 мин/планшет для одной длины волны. Описанные выше параметры соответствуют конкретному оборудованию в нашей лаборатории. Спектрофлуориметрические измерения: ксеноновая лампа-вспышка с шагом 1,0 нм с длиной волны возбуждения (250-850 нм) с регулируемой полосой пропускания 9 или 15 нм, детектор на трубке фотоумножителя с динамическим диапазоном > 6 логарифм и регулируемой полосой излучения 15 или 25 нм. Изображающий цитометр: источник света освещения, способный воспринимать белый свет, длину волны возбуждения 460 нм и 625 нм, полосу пропускания 20 нм, эмиссионные фильтры с центрацией на длинах волн 541 нм (полоса 108 нм) и 713 нм (полоса пропускания 123 нм) соответственно, и объектив с 4-кратным увеличением, соединенный с 1,25-мегапиксельной 12-битной камерой устройства с зарядовой связью.

2. Проба

Примечание: На момент анализа клетки должны быть на 70-90% слитыми. Во время этапов промывки средство следует извлечь и нанести на боковую стенку лунки (не непосредственно над ячейками). Поддерживайте температуру LLO на уровне < 4 °C для предотвращения его агрегации до шага 3.1.5.

1. Приготовьте массу 30 мкМ PI в М1 и массу 30 мкМ PI в М2, предварительно нагретую до 37 °C.
2. Аккуратно промойте клетки в планшете 1 с помощью 12-канальной микропипетки и наконечников объемом 200 мкл следующим образом:
   1. В условиях, не требующих ремонта, удалите питательную среду и дважды промойте ячейки 200 μл/лунка M1, предварительно нагретой до 37 °C. Замените среду на 100 μл/лунку теплого M1, содержащего 30 μM PI.
   2. Для восстановления ограничительных условий удалите питательную среду и промойте клетки один раз 200 μл/хорошо теплый M2, содержащий 5 мМ EGTA для хелатирования Ca²⁺, а затем одну промывку 200 μл/лунка M2. Замените среду на 100 мкл/хорошо прогретый M2, содержащий 30 мкМ PI.
   3. После того, как питательная среда была промыта и заменена средой, содержащей йодид пропидиума, сразу переходим к шагу 2.1.3.
3. Изображение на пластине 1 под проходящим светом, GFP и PI, как описано в 1.3.3 (до кинетики). Этот шаг занимает 15-20 минут.
4. В течение 15-минутного периода на шаге 2.1.3 подготовьте планшет 2 с помощью 12-канальной микропипетки и наконечников объемом 200 л следующим образом:
   1. Положите на лед 96-луночный полипропиленовый микропланшет с круглым дном. Сконфигурируйте пластину с помощью экспериментального проекта, соответствующего пластине 1 (рис. 1).
   2. Для ремонтно-восстановительных условий добавьте 100 μл/лунку ледяного M1, содержащего 60 μM PI, с последующим добавлением 100 μл/лунку ледяного M1, содержащего 4x LLO, или не добавьте для контроля.
   3. Для условий, ограничивающих ремонт, добавьте 100 μл/лунку ледяного M2, содержащего 60 μM PI, с последующим добавлением 100 μл/лунку ледяного M2, содержащего 4x LLO или не содержащего для контроля.
5. После получения изображения пластины 1 (шаг 2.1.3) немедленно поместите ее на лед, используя алюминиевую фольгу, чтобы отделить пластину от прямого контакта со льдом. Дайте тарелке 1 остыть в течение 5 минут.
6. С помощью 12-многоканальной микропипетки и наконечников объемом 200 мкл переведите по 100 мкл из каждой лунки в планшет 2 (шаг 2.1.4) в соответствующие лунки в планшете 1. Чтобы правильно распределить токсин в среде пластины 1, вставьте наконечники ниже мениска и аккуратно выдавите объем, не вводя пузырьков.
   Примечание: Не делайте пипетку вверх и вниз, так как это может привести к непреднамеренному отсоединению клеток.
7. Оставьте планшет еще на 1 минуту, чтобы токсин смог закрепиться в клетках, и немедленно перенесите планшет 1 на считыватель планшетов для кинетического анализа в режиме спектрофлуориметра (шаг 1.3.2).
8. В конце кинетического анализа немедленно сделайте изображение планшета 1 (посткинетического) с использованием шага 1.3.3.

3. Анализ: Перечисление ячеек

1. Определите количество клеток на основе ядерной флуоресценции с помощью программного обеспечения для подсчета клеток на микропланшетах.
   1. В разделе «Настройки» выберите «Повторный анализ», а в разделе «Категория» в разделе «Параметры анализа изображений» выберите «Анализ незаметных объектов», используя 541 в качестве длины волны для поиска объектов.
   2. В параметре «Найти объекты», используя метод поиска «Рисовать на изображениях», выберите «Ядра» на вкладке настроек и нажмите «Применить».
   3. Нажмите OK и Read, чтобы запустить алгоритм подсчета ячеек.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. На блок-схеме изображена репрезентативная конструкция пластины, сконфигурированная для проверки эффекта семи испытательных условий по сравнению с контрольными необработанными ячейками. При необходимости следует предусмотреть дополнительные меры контроля, например, транспортные средства для приема лекарственных препаратов. Клетки покрываются гальваническим покрытие...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SpectraMax i3x Многорежимный считыватель микропланшетов	Молекулярные приборы	i3x
MiniMax 300 Цитометр для визуализации	Молекулярные приборы	5024062
ТО-ПРО-3	ThermoFisher Scientific	Т3605
Йодид пропидиума	ThermoFisher Scientific	П3566
HeLa	АТКС	CCL2
HeLa H2B-GFP	Многородность	ПКК117
Трипсин-ЭДТА 0,25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-луночная пластина с плоским дном Corning с черным полистиролом для обработки культуры тканей	Корнинг	3603
Сбалансированные соли Хэнкса	Сигма-Олдрич	Н4891
ЭГТА	МСК «БиоЭкспресс»	0732-100Г
ХЕПЕС	Научный центр Фишера	БП310-500
D-(+)-глюкоза, HybriMax	Сигма-Олдрич	Г5146-1КГ