Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Фиксация тканей формалином
- Поместите 3-5 мм тканей мозга, собранных после вскрытия, в 10% фосфатно-буферный раствор формалина (соотношение ткань/формалин от 1:20 до 1:50) на 24-72 ч.<бр/>
осторожность: Формалин является токсичным фиксатором.
- Запишите приблизительный вес (размер) ткани, тип ткани (области мозга) и объем формалина. Для лабораторий важно документировать и вести учет времени фиксации.
- Для более длительного хранения тканей после фиксации формалина и перед обработкой поместите ткань в 70% этанол.
2. Обработка тканей
- После фиксации образца рассеките ткань, чтобы включить в нее важные участки мозга, например, поперечные сечения ствола мозга, мозжечка (3 доли) или гиппокампа (оба гиппокампа), каждый из которых имеет толщину от 3 до 5 мм и помещен в технологические кассеты.
- Обрабатывают тканевые кассеты для инфильтрации парафином, засаживают в парафиновые блоки и разрезают (от 3 до 6 мкм) на микротоме.
3. Подготовка материалов / Окрашивание посуды
- Установите чашку для окрашивания (Table of Materials), как показано на рисунке 1. Наполните каждую чашку 250 мл раствора.
- Приготовление исходного раствора субстрата 3-Амино-9-этилкарбизол (АЭС)
- Растворите одну таблетку 20 мг 3-амино9-этилкарбазола (АЭС) в 5 мл N,N, диметилформамида с помощью стеклянной пипетки.
осторожность: AEC является канцерогеном.
- Приготовление стокового раствора протеазы (например, проназы) для извлечения антигена
- Растворите 7 мг протеазы в 200 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Приготовление буфера для полоскания PBS-T
- Добавьте от 10 мл Tween 80 до 990 мл PBS. Хорошо перемешайте его до образования однородного раствора.
4. Депарафинизация и регидратация тканей
- С помощью микротома сделайте парафиновый срез размером 5 мкм, всплывите на водяной бане при температуре 38 °C и соберите на предметные стекла. Пометьте слайды ручкой/маркером, устойчивым к реагентам.
- Выложите горки на противень и растопите в духовке при температуре 55-60 °C в течение 1 часа. Не поднимайте температуру выше 60 °C, так как это может разрушить вирусный антиген.
- Выньте предметные стекла из духовки и немедленно депарафинизируйте в 3 последовательных полоскании ксилолом по 5 минут каждый в посуде 1, 2 и 3.
- Регидратация секций на предметном стекле путем последовательного погружения в уменьшающееся разбавление этанола до деионизированной воды: (с 4 по 11 - ополаскивание погружением) чашка 4: ксилол/100% этанол (1:1); чашка 5: 100% этанол; чашка 6: 100% этанол; чашка 7: 95% этанол; чашка 8: 95% этанол; чашка 9: 80% этанол; чашка 10: 70% этанол; чашка 11: деионизированная вода (Рисунок 1. Настройка тарелки).
осторожность: Ксилол является опасным химическим веществом, и работа должна проводиться в вытяжном шкафу.
5. Извлечение протеолитического антигена
- Обрабатывайте предметные стекла протеазой (2,5 мкг/мл PBS) в течение 30 мин для извлечения протеолитического антигена в чашке 12.
- Затем промыть в PBS-T в течение 10 мин (чашка 13).
- Обработать 3% перекисью водорода в течение 10 мин (чашка 14).
- Снова вымыть PBS-T в течение 10 минут (посуда 15).
6. Процедура окрашивания
- Обрабатывайте слайды по одной, удерживая оставшиеся слайды погруженными в буфер (не снимайте весь держатель слайдов - держите слайды влажными). Снимите одно предметное стекло и промокните излишки буфера (бумажным полотенцем) вокруг участка ткани, стараясь не повредить участок ткани. Инкубировать предметные стекла в камере влажности, сделанной путем размещения смоченных бумажных полотенец, на столе лабораторного стола при комнатной температуре с обычной козьей сывороткой (блокировкой) в течение 15 минут.
- Инкубировать с оптимальным предварительно определенным разведением первичных антител против бешенства (разведение сыворотки против бешенства мышей в масштабе 1:250, не опубликовано) и антител отрицательного контроля при комнатной температуре, как указано выше (шаг 6.1), в течение 60 мин без промывок.
- Через 60 минут умыться с PBS-T в течение 10 минут (чашка 16).
- Инкубировать с биотинилированным антителом (видоспецифичным) в камере влажности при комнатной температуре в течение 15 мин (обработка аналогична шагу 6.1.).
- Вымыть с помощью PBS-T в течение 10 минут (посуда 16).
- Инкубировать комплексом стрептавидин-хренпероксидаза (HRP) в камере влажности при комнатной температуре в течение 15 мин (обработка аналогична 6,1).
- Вымыть с помощью PBS-T в течение 10 минут (посуда 16).
- Инкубировать с пероксидазным субстратом, аминоэтилкарбазолом (АЭС), в камере влажности при комнатной температуре в течение 10 мин. Приготовить АЭЦ непосредственно перед использованием. Для этого добавьте 1 мл стокового раствора AEC к 14 мл 0,1М ацетатного буфера, pH 5,2. Добавьте 0,15 мл 3% перекиси, Н2О2. Отфильтруйте смесь непосредственно перед использованием (фильтр 0,45 мкм).
заметка: Рабочий раствор AEC стабилен только в течение 2-3 часов. Стоковый раствор AEC можно хранить в холодильнике в течение более длительного времени.
- Промыть в деионизированной воде в течение 10 минут (чашка 17)
- Противостоит гематоксилину Гилла, разбавленному в соотношении 1:2 с деионизированной водой в течение 2 мин (чашка 18).
- Излишки гематоксилина смыть деионизированной водой, ополоснуть водой (посуда 19 и 20).
- Промыть в водопроводной воде Скотта в течение 30 с (раствор для воронения) посуду 21.
- Промыть в деионизированной воде в течение 10 минут (чашка 22)
- Снимайте слайды по одному - закрепите с помощью водорастворимого монтажного носителя.
- Чтение слайдов на световом микроскопе.
