$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Гистопатологическая подготовка и обработка после биопсии височной артерии
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия височной артерии (TAB) выполняется под местной анестезией и в стерильных условиях сертифицированным хирургом. После хирургического получения артериального среза длиной 3 см на более пораженной стороне, образец немедленно фиксируют в формалине на 24 ч, разделяют на срезы по 3-4 мм и погружают в парафин, уделяя особое внимание правильному выравниванию ткани в блоке, который затем хранится при комнатной температуре. Отбор образцов осуществляется после проверки медицинской документации. Диагноз основан на критериях Американского колледжа ревматологии 1990 года, которые требуют, чтобы субъекты соответствовали 3 из 5 критериев: возраст >50 лет, новая головная боль, болезненность височной артерии, скорость оседания эритроцитов >50 мм/час по методу Вестергрена и аномальная ТАБ. Для безопасности необходимо постоянно носить защитные перчатки при работе с образцами. химические вещества и антитела.
- Из закладных блоков вырезают срезы толщиной 4-5 мкм с помощью микротома и окрашивают гематоксилином и эозином (H&E). Используйте контрольный срез выбранной нормальной ткани для обеспечения качества.
- Вырежьте срезы на теплой водяной бане, нагретой до 40 °C, чтобы удалить складки, и подберите их микроскопическим стеклом с покрытием. Поместите стеклянные стекла на теплую тарелку в духовку при температуре 60 °C на 60 минут, чтобы облегчить высыхание и прилегание сечения к предметному стеклу.
- Поместите стеклянные предметные стекла на теплую тарелку в духовку при температуре 60 °C на 60 минут, чтобы облегчить высыхание и прилегание сечения к предметному стеклу.
- Закрепите 3 секции на предметных стеклах микроскопа.
- Поместите предметные стекла в вертикальную решетку и высушите в течение ночи при температуре 37 °C в течение 24 часов.
- Поместите предметные стекла в контейнер и храните при температуре 4 °C.
2. Иммуногистохимическая подготовка, депарафинизация, извлечение антигена и окрашивание
- Загрузите слайды в решетку для слайдов. Проведите решетку по чашкам следующим образом: дважды в 100% ксилоле в течение 5 минут с 10 секундами осторожного перемешивания каждые 30 секунд, один раз в 100% этаноле с 10 секундами перемешивания, один раз в 90% этаноле с 10 секундами перемешивания, один раз в 70% этаноле с 10 секундами перемешивания и дважды в двойном перегонном H2O с 10 секундами перемешивания.
заметка: Работу с ксилолом и ацетоном следует проводить в вентилируемых капюшонах, чтобы избежать вдыхания и респираторной токсичности.
- Извлеките антиген, переложив штатив в стеклянный контейнер с 200 мл 10 ммоль/л, буфер цитрата pH 6,0, предварительно нагретый до 95 °C. Установите таймер на 30 минут на водяной бане, затем охладите при комнатной температуре в течение 20 минут, затем промойте проточной водой в течение 5 минут.
- Удалите активность эндогенной пероксидазы путем инкубации в 200 мл 3% перекиси водорода в течение 10 минут. Промыть предметные стекла 3 раза в 200 μл трис-буферного физиологического раствора (ТБСС).
- Снимите предметные стекла со стойки и аккуратно промокните каждый из них, чтобы удалить излишки буфера. Для окрашивания добавьте 200 мкл следующих первичных антител, добавьте покровные стекла на предметных стеклах и инкубируйте во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре:
Антитела к бета-рецептору фолиевой кислоты (FRB) разбавлены в соотношении 1:800
Моноклональный мышиный античеловеческий CD68, разведение 1:200
Поликлональный кролик анти-CD3 1:100 разведение
заметка: Фиксированные формалином участки плаценты, залитые парафином, также обрабатывали, как описано в шагах 2.1-2.9, инкубировали с анти-FRB18 и использовали в качестве положительного контроля. Результаты окрашивания получали путем нахождения оптимальной концентрации антитела и проводили путем титрования антитела в двойных разведениях (например, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Снимите покровную крышку после инкубации и выбросьте. Промойте предметные стекла 3 раза по 2 минуты с TBSS, слейте воду и протрите излишки буфера.
- Добавьте 200 мкл раствора вторичного антитела, содержащего биотинилированное вторичное антитело Anti-rabbit/Mouse для реакции с неконъюгированным первичным антителом, связанным с тканевым антигеном. Поместите покровные стекла на предметные стекла и выдерживайте во влажной камере в течение 45 минут при комнатной температуре.
- Снимите покровную крышку после инкубации и выбросьте. Промойте предметные стекла 3 раза по 2 минуты с TBS, слейте воду и протрите излишки буфера.
- Добавьте 200 мкл системы диаминобензидин (DAB) + субстратный буфер (Имидазол гидрохлорид) -хромоген и инкубируйте в течение 10 минут для визуализации картины окрашивания. Промыть с помощью TBSS, затем в проточной воде из-под крана в течение 10 минут.
- Контрокрашивание гематоксилином в течение 3 минут.
- Установите предметные стекла, нанеся на поверхность предметного стекла 70 μл монтажного материала. Медленно накиньте покровное стекло на монтажный носитель и избегайте образования пузырей при опускании его на место. Подождите 24 часа для высыхания.
3. Гистопатологический и иммуногистохимический анализ (ИГХ)
Исследуйте окрашенные H&E и IHC срезы у GCA-положительных и нормальных субъектов с помощью светового микроскопа.
- Для окрашенных участков H&E
- Оцените сосудистую архитектуру и определите эндотелиальные клетки в внутренней оболочке, гладкомышечные клетки в средней оболочке, а также фибробласты и vasa vasorum в сосудистой оболочке.
- Определите признаки ГКА, которые включают инфильтрацию лимфоцитов и макрофагов/гистиоцитов, клеточную гиперплазию и деградацию внутренней эластической пластинки.
- Анализируйте лимфогистиоцитарный инфильтрат путем идентификации и количественной оценки количества макрофагов относительно лимфоцитов. Оцените степень разрушения внутренней эластической пластинки и гиперпластических изменений в резидентных клетках и сравните их с контрольной группой.
- Для окрашенных секций IHC
- Изучите характер окрашивания FRB, обращая внимание на его экспрессию определенным типом или типами клеток, его распределение в сосудистых слоях и его связь с общим иммунным инфильтратом, общим макрофагальным маркером, анти-CD68 и панлимфоцитарным маркером анти-CD3.
- Количественно оцените экспрессию клеток FRB, CD68 и CD3 путем подсчета положительно окрашенных клеток на 10 множественных случайно выбранных полях высокой мощности (HPF) и запишите средние значения.
заметка: Идентификация этих нормальных и патологических клеток и структур была выполнена сертифицированным сердечно-сосудистым патологом и ревматологом, и результаты были зарегистрированы для всех случаев.
- Съемка репрезентативных изображений с помощью цифровой камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этих шагов оставшиеся аликвоты можно хранить при температуре -80 °C.