Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Забор тканей и УФ-кросслинкинг
- Усыпьте 2 взрослых мышей с использованием углекислого газа (CO2) в течение 1-2 минут или до остановки дыхания. Далее выполните шейный вывих каждой мыши.
- Соберите около 100 мг семенников у мышей соответствующего возраста (одно взрослое яичко в этом исследовании) для каждого эксперимента по иммунопреципитации и поместите ткани в ледяной фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Аккуратно снимите белочную оболочку с помощью пинцета с тонким концом.
- Добавьте 3 мл ледяного PBS в измельчитель для салфеток и растирайте ткань с помощью мягкой механической силы с помощью незакрепленного стеклянного пестика (стеклянный пестик типа А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага — не лизировать клетки, а разъединить ткань. Сохранение жизнеспособности и целостности клеток имеет важное значение.
- Перенесите тканевую суспензию в чашку для клеточной культуры (диаметром 10 см) и добавьте ледяной PBS до 6 мл.
- Быстро встряхните тарелку, чтобы жидкость равномерно покрыла дно блюда. Если ткань правильно измельчена, будут видны равномерно распределенные семенные канальцы, в то время как наличие тканевых комков указывает на то, что дисперсия тканей является неоптимальной.
- Трижды сшить суспензию по 400 мДж/см2 при длине волны 254 нм на льду. Смешивайте суспензию между каждым облучением.
заметка: Для каждого нового эксперимента следует оптимизировать сшивку.
- Соберите суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и принимайте гранулы при давлении 1 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS, а затем перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Вращайте при температуре 4 °C и 1 000 x g в течение 2 минут и удалите надосадочную жидкость.
- На этом этапе немедленно приступайте к остальной части протокола или заморозьте гранулы в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до использования.
2. Подготовка бисера
- Добавьте 125 μл магнитных шариков белка А на образец (гранулу) в свежую пробирку центрифуги.
заметка: Используйте магнитные шарики белка G для антител мышей.
- Поместите трубку на магнит, чтобы отделить шарики от раствора. Через 10 с удалите надосадочную жидкость. Дважды промойте шарики 1 мл ледяного буфера для лизиса.
заметка: Последующее разделение магнитных шариков белка А следует за этим шагом. Лизисный состав буфера составляет 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl; 1% НП-40; 0,1% SDS; 0,5% дезоксихолат натрия; 1/50 коктейль ингибиторов протеазы без этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (добавить в свежем виде).
- Ресуспендируйте гранулы в 100 мкл буфера для холодного лизиса с 10 мкг антитела eCLIP. Вращайте трубки при комнатной температуре в течение 45 мин.<бр/>
заметка: Конечная концентрация антител для иммунопреципитации составляет 10 мкг/мл. Если концентрация антител неизвестна, количество антител следует оптимизировать.
- Дважды промойте бусины 1 мл ледяного буфера для лизиса.
3. Лизис тканей и частичное расщепление РНК
- Ресуспендируйте тканевые гранулы в 1 мл буфера для холодного лизиса (добавьте 22 мкл 50-кратного (ЭДТА) коктейля ингибиторов белка и 11 мкл ингибитора РНКазы к 1 мл буфера для лизиса).
- Ресуспендирование двух УФ-сшитых гранул и двух несшитых гранул на группу экспериментов: УФ-сшитые гранулы-1 для библиотеки eCLIP (UV-1); гранулы UV-crosslinked-2 для библиотеки eCLIP (UV-2); гранулы без сшивки-1 для библиотеки eCLIP в качестве контроля (без UV); несшитые-2 гранулы для IgG IP для демонстрации специфичности антител.
заметка: Идеальным средством контроля для библиотеки eCLIP УФ-сшитых широкоформатных яичек является использование УФ-сшитых нокаутных яичек мышей одного и того же помета.
- Продолжайте лизировать образцы на льду в течение 15 минут (чтобы предотвратить деградацию белка и РНК).
- Проводите ультразвуковую обработку в цифровом ультразвуковом аппарате с амплитудой 10% в течение 5 мин, при включении/выключении 30 с. Всегда кладите образец на лед и очищайте зонд водой без нуклеаз между каждым образцом.
- Добавьте 4 мкл ДНКазы в каждую пробирку и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 °C, встряхивая при 1 200 об/мин.
- Добавьте 10 мкл разбавленной РНКазы I (4 Ед/мкл РНКазы I в PBS) и хорошо перемешайте. Выдерживать в течение 5 минут при температуре 37 °C, встряхивая при 1 200 об/мин.
- Очистите лизат центрифугированием при температуре 15 000 x g в течение 20 минут (при 4 °C).
- Тщательно соберите надосадочную жидкость. Оставьте 50 мкл лизата и выбросьте вместе с ним гранулу.
- Сохраняйте входные образцы как RWB (прогон для западного блоттинга) и RRI (прогон для выделения РНК). Сохраняйте 20 мкл (2%) образцов UV-1, UV-2, не-UV и IgG в качестве входных данных для загрузки геля RWB. Сохранение 20 μл (2%) образцов UV-1 или UV-2 в качестве входных данных для загрузки геля RRI.
4. Иммунопреципитация
- Добавьте 1 мл лизата (из шага 3.7) в гранулы (приготовленные в разделе 2) и вращайте образцы при температуре 4 °C в течение 2 часов или на ночь.
- Соберите бусины с помощью магнитной подставки и выбросьте надосадочную жидкость. Дважды промойте шарики 900 μЛ буфера с высоким содержанием солей (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% дезоксихолата натрия), а затем дважды промойте бусины 900 μL буфера для промывки (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
заметка: Для образца IgG приостановите процедуру здесь и храните его на льду в буфере для промывки.
